내분비 및 외분비 리 프로그래밍과 대량 살상 무기 확산 모델로 췌관의 결찰을 통해 마우스 췌장 외과 부상
Summary
This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.
Abstract
배아 또는 성체 줄기 세포에서 분화에 의해 생체 내 또는 생체, 또는 베타 세포의 생성에 췌장 베타 세포의 확장, 당뇨병에 대한 치료와 같은 인간의 췌장 이식의 기증자 부족을 완화하는 베타 세포의 새로운 확장 소스를 제공 할 수 있습니다. 최근의 진보는이 목적으로 이루어졌다하더라도, 줄기 / 전구 세포에서 베타 세포의 확장 및 분화를 조절하는 메커니즘을 특징으로하는 것으로 남아있다. 여기에서, 우리는 조직 리모델링 및 베타 세포의 증식과 분화의 메커니즘을 연구하는 도구로 기능 할 수 성인 마우스의 췌장에 손상 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다. 부분 덕트 결찰 (PDL)은 췌장의 꼬리 부분 중 외분비 제품의 배수의 방해의 결과로 주 췌관의 수술 적 결찰을 포함하는 설치류 췌장의 실험적으로 유도 된 부상입니다. 입은 피해는 선포 위축, 면역 세포 infilt을 유도배급 심각한 조직 리모델링. 우리는 이전에 내인성 전구 세포와 같은 PDL 후 베타 세포 증식의 증가를 표현 Neurogenin (NGN) (3)의 활성화를보고했다. 따라서, PDL은 베타 세포 역학에 관련된 신호 및 성인 췌장 내분비 선조의 특성을 연구하는 기초를 제공한다. , 아직도 요인과 경로는 PDL의 베타 세포의 신생 및 확산에 기여하는, 크게 불분명하기 때문에, PDL에 대한 표준화 된 프로토콜은 실험실에서 비교하실 수 있습니다.
Introduction
억명 이상의 사람들이 세계적 1,2- 영향을 당뇨병의 증가하는 유병률은, 결핍 베타 세포 질량을 보충하기 위하여, 시험 관내 및 생체 내 인슐린 – 생산 베타 세포의 새로운 소스에 대한 검색을 증폭했다. (3)가 키 확인 베타 세포 증식 및 베타 세포 신생, 즉, 비 – 베타 세포 또는 전구 세포에서 베타 세포의 분화를 조절하는 메커니즘과 인자는 당뇨병 치료의 회생 발전을위한 새로운 표적을 제공 할 수있다.
현상 쥐 췌장에서, 내분비 세포 유형은 모두 전사 인자 Neurogenin3 (Ngn3) 발현, 내분비 선조 세포의 일시적인 인구 차별화. 4,5 성인 쥐 췌장에서 정상적인 생리 학적 조건 하에서, 베타 세포 질량이고 최적의 수를 유지 대사 요구를 충족합니다. 베타 세포 크기 변화,베타 세포의 전위 정상적인 생리적 조건 하에서 증식하면서 아폽토시스 및 복제 모집단 전체에 균질 베타 세포의 팽창 및 젖혀. 6-8를위한 주요 메커니즘을 구성하고, 구 증식 속도가 낮으며, 다시 복제가 제한되고 연령 및 당 대사에 영향을 동적 정지 기간 또는 내화성 기간 6,7. 10 내분비 전구 세포가 원경 정상 성인 췌장에서 발견되지 않았으므로이 신생이없는 정상 성인 베타 세포 성장에 기여하는 것으로 생각된다. (8)
따라서, 팽창 및 신규 한 베타 세포의 가능한 소스를 무제한 제공 할 새로운 베타 세포를 수득 할 수있는 성인 췌장 내분비 통성 전구 세포의 동정.
덕트 부분 결찰 (PDL)의 베타 세포를 유도하는 neogenesi 설명 하였지만 동물 손상 모델이며성인의 췌장에서의.이 모델에서 11, 12, 췌장 꼬리를 배출의 주요 췌장 관은 수술 결찰한다. 외분비 배수의 결과 장애물이 염증 환경 내에서 염증 및 결찰에 말단 선포 위축. 12 ~ 14과 함께 주요 조직 리모델링을 유도 Ngn3 유도하는 내분비 전구 마커 및 베타 세포 부피의 재 발현은 두 배 증가 . 배아 형 내분비 전구 세포 및 "정지 기간"없이 중복을 다시하는 경향이 기존 및 새롭게 형성된 베타 세포의 증식을 발현 Ngn3 신규 베타 세포의 세대로부터 베타 세포 부피 결과에서이 두배. 11, 15
이러한 6,7,16-19 및 췌장 베타 세포 (20)의 선택적 제거와 같은 손상 모델에서 베타 세포 신생 및 복제는 광범위하게 설명되었다. 살전에 그러나 회생 결과E 모델 입은 손상의 정도에 의해 영향을 감소하고 초기 베타 세포 덩어리 (21)와 관련된다. PDL은 초기 베타 세포 질량의 영향을받지 않으므로 베타 세포 신생 증식 견고하게 활성화되는 수술 모델이다. 실제로, PDL을받은 생쥐의 췌장, Ngn3 발현 세포는 도관의 상피 라이닝 근처 식별된다. 이 세포들은 정렬 형광 활성 셀 (FACS)를 사용하여 Ngn3-GFP 형질 전환 마우스의 결찰 췌장에서 분리 E12.5 Ngn3의 췌장과 체외 문화에 생착 다음과 같은 기능 베타 세포으로 구별 할 수있다 할 수 – / – . 쥐 11 마찬가지로, Ngn3 CreERT 단계;. Ngn3 유전자를 활성화 세포 영구적 타목시펜 분사 라벨 양성 Ngn3 세포 유래 베타 세포가 PDL 후 검출 된 후에 표지 된 R26 YFP 마우스 (15)는 또한, 새로 형성된 베타 세포를 미리 희석 -exist대상별 짧은 헤어핀 RNA를 크게 베타 세포 질량과 베타 세포 증식 후 감소하여 Ngn3 식을 감소하기 때문에 베타 세포를 보내고 우선적으로 베타 세포 높은 증식 잠재력을 표시하는 내 작은 섬에 위치. 15 Ngn3는 PDL 후 베타 세포의 확장을위한 중요 PDL. (11)는 특히, PDL 후 Ngn3 세포 유래 베타 세포의 분획과 베타 세포 질량 비판적 Ngn3 유도 (15)의 레벨에 의존한다. R26 IDTR 마우스,. 이것은, Ngn3가 Ngn3 CreERT에 디프테리아 독소 관리에 의해 발현 세포의 선택적 제거 Ngn3 식의 높은 수준의 췌장 개발하는 동안 능성 췌장 전구 세포에서 내분비 노력을위한 중요한 단계입니다 관측에 따른 것이다 또한 (22) 특히 작은 아일렛의 인슐린 함유량 감소와 감소 된 베타 세포 증식을 초래한다. 15
<pPDL 후 도관 세포에서 Ngn3 식의 유도가 많은 11,15,16,23,24에 의해 확인되었지만 클래스 = "jove_content">, PDL의 결과에 섬 세포 (24, 25)과의 불일치에 Ngn3 표현은 우리의 초기 관찰 도전 증가 베타 세포 질량의 26, 27, Ngn3의 외관은 PDL 후 덕트 파생 내분비 전구 세포 24,26,28,29, 증가 베타 세포 증식 (27)을 표현. (30)이러한 충돌 결과는 적어도 부분적으로, 가장 중요한 마우스, 수술 후 생리 및 환경 조건으로, 분석, 체중, 성별과 연령의 수술 – 후 시점의 변동 등 다양한 요인들의 조합에 기인 할 수있다 수술 기법의 차이. 우리의 손 (30), 베타 세포 증식, 인슐린 함량, β- 세포 부피와 작은 섬의 수는 지속적으로 PDL 후에 증가된다. 또한Ngn3의 mRNA는 지속적으로 증가하지만, 우리가 직접 설명이 없습니다있는 PDL 꼬리 췌장, 간 Ngn3 mRNA 발현에 큰 차이가 있습니다. 우리는 Ngn3의 mRNA 수준이 아닌 베타 세포에서 15 베타 세포 신생의 정도와 상관 관계가 있음을 가정 할 수 있지만, 이는 더 실증이 필요하다. 이 모든 실험 변형을 제거하지 않지만, PDL 수술을 수행하는 표준화 된 방법은 결과에 더 나은 균일 성을 허용하고 베타 세포의 증식과 신생 연구에 새로운 길을 엽니 다.
Protocol
Representative Results
Discussion
In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).
Materials
| Supplies for preparation area | |||
| Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
| Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
| Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
| Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
| Razor | |||
| Supplies for surgical area | |||
| Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
| autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
| Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
| Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
| OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
| Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
| Mini Plasco 0,9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
| Supplies for recovery area | |||
| Paper bedding (paper towel) | |||
| Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
| Materials for analysis | |||
| Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
| Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
| anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
| anti-mouse/rat Ki67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
| monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
| anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
| monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
| Hoechst | Sigma | 33342 |
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