This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.
Bir embriyo veya yetişkin kök hücre farklılaşması ile in vivo veya ex vivo veya beta hücrelerinin üretimi pankreatik beta hücrelerinin genişlemesi, diyabet için bir tedavi olarak, insan doku adacığı transplantasyonundan verici kıtlığı hafifletmek için beta hücrelerinin yeni bir genleşebilen kaynaklar sağlar. Son gelişmeler bu amaca yönelik yapılmış olmasına rağmen, bir kök / progenitör hücreden beta hücre genişlemesi ve farklılaşmasını düzenleyen mekanizmalar karakterize edilmesi gerekmektedir. Burada, doku tekrar modellemesinde ve beta hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının mekanizmaları incelemek için bir araç olarak işlev görebilir yetişkin fare pankreası bir yaralanma modeli için bir protokol açıklar. Kısmi kanalı ligasyonu (PDL) pankreas kuyruk bölgesi dışına ekzokrin ürünlerinin drenaj tıkanma sonucu ana pankreatik kanal cerrahi ligasyon içeren kemirgen pankreasın bir deneysel yaralanma olduğunu. tahribatını asiner atrofi, bağışıklık hücre infilt uyarmaktadırrasyon ve şiddetli doku yeniden. Biz daha önce endojen progenitör benzeri hücreler ve PDL sonra beta hücre çoğalmasında bir artış ifade Neurogenin (NGN) 3 aktivasyonunu bildirmiştir. Bu nedenle, PDL beta hücre dinamikleri katılan sinyalleri ve yetişkin pankreas endokrin progenitör özelliklerini incelemek için bir temel sağlar. , Hala faktörler ve yollar PDL beta hücre neojenezi ve çoğalmasına katkıda bulunan, büyük ölçüde belirsizdir yana, PDL için standart protokol laboratuvarlar arasında karşılaştırma için izin verecektir.
300 milyondan fazla insanlara dünya çapında 1,2 etkileyen diyabet prevalansı artan, yetersiz beta hücre kitlesi doldurmak için, in vitro ve in vivo olarak, hem insülin üreten beta hücrelerinin yeni kaynaklar arama artırmıştır. 3 anahtar belirleme beta hücre çoğalması ve beta hücre neojenezi, örneğin, non-beta hücre veya projenitör hücresi beta hücrelerinin farklılaşmasını düzenleyen mekanizma ve faktörleri, diyabetlerde rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için yeni hedefler sağlayabilir.
Gelişmekte olan kemirgen pankreas olarak, endokrin hücre tipleri transkripsiyon faktörü Neurogenin3 (Ngn3) ifade eden, endokrin progenitör hücrelerin geçici popülasyonundan ayırt. 4,5 yetişkin kemirgen pankreas olarak, normal fizyolojik koşullar altında, beta hücre kütlesi optimal sayıda tutulan metabolik ihtiyaçlarını karşılamak için. Beta hücre boyutundaki değişiklikler,beta hücrelerinin potansiyel normal fizyolojik koşullar altında prolifere iken apoptoz ve çoğaltma nüfusun genelinde homojen beta hücre genişlemesi ve dönüş bitti. 6-8 başlıca mekanizmalar oluşturan, 9 onların çoğalması oranı düşüktür ve yeniden çoğaltma sınırlandırıldı yaş ve glukoz metabolizması etkilenir dinamik bir sessizlik dönemi veya refrakter dönem 6,7. 10 endokrin progenitör hücreler kadar normal yetişkin pankreas tespit edilmemiştir beri, neojenezini normal erişkin beta hücre büyümesine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. 8
Bu nedenle, genişletilebilir ve bir roman, beta hücrelerinin muhtemelen sınırsız bir kaynak sağlayacak yeni beta hücrelerini verimli yeteneğine sahip yetişkin pankreasta bir fakültatif endokrin progenitör hücre tanımlaması.
Kısmi kanalı ligasyonu (PDL) beta hücre neogenesi indüklediği tarif edilmiş bir hayvan yaralanması modeliYetişkin pankreasın s. Bu modelde 11,12, pankreas kuyruk boşaltma ana pankreatik kanal cerrahi bağlanır. ekzokrin drenaj elde edilen tıkanma inflamatuvar ortamında enflamasyon ve ligasyon distal asinar atrofi. 12-14 ile birlikte ana dokuların yeniden indükler, Ngn3 indüklenir endokrin progenitör işaret ve beta hücre hacmi yeniden ekspresyonu, iki kat artar . Embriyonik tip endokrin progenitör hücre ve "sessizlik dönemi" olmadan-çoğaltılması yeniden eğilimli önceden varolan ve yeni kurulan beta hücrelerinin çoğalmasından ifade eden Ngn3 yeni beta hücrelerinin kuşağa beta hücre hacmi sonuçlarında bu iki katına. 11,15
Bu tür pankreatektomi 6,7,16-19 ve beta hücrelerinin 20 seçici ablasyonu gibi yaralanma modellerinde, beta hücre neojenezini ve çoğaltma yoğun tarif edilmiştir. Thes içinde Ancak, rejeneratif sonuçE modelleri hasarın ölçüde etkilenir ve azalmış ilk beta hücre kütlesi 21 ile ilişkilidir. PDL başlangıç beta hücre kütlesi etkilenmez ve beta hücre neojenezini ve proliferasyon sağlam aktive olan bir cerrahi bir modeldir. Gerçekten de, PDL uygulanan farelerin pankreasında, Ngn3 ifade eden hücreler, kanalın epitelial yakınında tespit edilir. Bu hücreler, THP (FACS) kullanılarak Ngn3-GFP transgenik farelerin lige pankreas izole edilir ve E12.5 Ngn3 pankreas ve ex vivo kültür içinde bir nakil aşağıdaki işlevsel p hücrelere karşı ayırt etmek mümkün olabilir – / – . farenin 11 Benzer şekilde, Ngn3 CreERT olarak;. Ngn3 genini aktive hücreler sürekli olarak tamoksifen, enjeksiyon, etiket-pozitif Ngn3 hücresinden türetilmiş beta hücreleri PDL sonra tespit sonra etiketlenir ki burada R26 YFP fareler 15 Ayrıca, yeni oluşan beta hücreleri, önceden seyreltilmiş -existHedef spesifik kısa saç tokası RNA anlamlı beta hücre kitlesi ve beta hücre çoğalmasını sonra azalır kullanarak Ngn3 ifadesini azalmış beri beta hücrelerini ing ve tercihen beta hücrelerinin yüksek çoğalma potansiyeli gösteren, içinde küçük adacıklar bulun. 15 Ngn3 PDL sonra beta hücre genişlemesi için önemli olan PDL. 11 Özellikle, PDL sonra Ngn3 hücresinden türetilmiş beta hücrelerinin fraksiyonu ve beta hücre kütlesi kritik Ngn3 indüksiyonu 15 seviyesine bağlıdır. R26 iDTR fareler;. Bu, Ngn3 Ngn3 CreERT difteri toksin verilmesi ile ifade eden hücrelerin seçici şekilde kesip çıkarılması Ngn3 yüksek ifade seviyesi, pankreas gelişimi sırasında multipotent pankreatik progenitörlerinden endokrin bağlılık için kritik bir adım olduğu gözlemiyle uyumludur ek olarak 22 Özellikle küçük adacıkları azalma insülin içeriğine ve düşük beta hücre çoğalması ile sonuçlanır. 15
<pPDL sonra kanal hücrelerinde Ngn3 ifade indüksiyon birçok 11,15,16,23,24 tarafından onaylandıktan rağmen class = "jove_content">, PDL sonucuna ilişkin adacıklar hücreleri 24,25 ve tutarsızlıklar içinde Ngn3 ifadesi bizim ilk gözlemler meydan artan beta hücre kitlesi 26,27 arasında, Ngn3 görünümü PDL sonra kanal kaynaklı endokrin atalarıdır 24,26,28,29 ve artan beta hücre çoğalmasını 27 dile getirdi. 30Bunlar çelişkili sonuçlar, en azından kısmen, en önemlisi fareler, post-operatif fizyolojik ve çevresel koşullar ve analizi, vücut ağırlığı, cinsiyet ve yaş ameliyat sonrası zaman noktalarında varyasyonlar dahil faktörlerin bir kombinasyonu isnat edilebilir Cerrahi teknik farklılıklar. Bizim ellerde 30 beta hücre çoğalması, insülin içeriği, beta hücre hacmi ve küçük adacıklar sayısı sürekli PDL sonra artmıştır. AyrıcaNgn3 mRNA sürekli artar ama biz doğrudan açıklama var olan PDL kuyruk pankreaslarından arasında Ngn3 mRNA ekspresyonu büyük farklılıklar vardır. Biz Ngn3 mRNA seviyesi, beta hücrelerinden 15 gelen beta hücre neojenezi derecesi ile ilişkili olabilir hipotezi, ama, bu da ispat gerektirir. Tüm deneysel varyasyonları kaldırmak olmamasına rağmen, PDL ameliyatı gerçekleştirmek için standart bir yöntem sonuçlarında daha iyi tekdüzelik sağlar ve beta hücre çoğalmasını ve neojenezini okuyan yeni yollar açar.
In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).
Supplies for preparation area | |||
Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
Razor | |||
Supplies for surgical area | |||
Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
Mini Plasco 0,9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
Supplies for recovery area | |||
Paper bedding (paper towel) | |||
Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
Materials for analysis | |||
Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
anti-mouse/rat Ki67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
Hoechst | Sigma | 33342 |