Оценка эндотелиальной миграции клеток после воздействия токсичных химических веществ
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
Воздействие химических веществ (в том числе алкилирующих агентов химического оружия, как серы и азота горчицы) вызывают множество клинических симптомов, включая заживления ран расстройства. Физиологический процесс заживления ран является очень сложным. Формирование грануляционной ткани является ключевым шагом в этом процессе, в результате предварительного закрытия раны и обеспечивая сеть новых капиллярных кровеносных сосудов – либо через васкулогенеза (образование роман) или ангиогенез (прорастание существующих судов). Оба vasculo- и ангиогенез требует функциональной, направленную миграцию эндотелиальных клеток. Таким образом, исследование раннего эндотелиальных клеток (ЕЭС) миграции важно понимать, патофизиологии химически индуцированных расстройств заживления ран и потенциально идентифицировать новые стратегии для терапевтического вмешательства.
Мы оценили ухудшение заживления ран после алкилирования экспозиции агента и проходят потенциальных соединений-кандидатов для трeatment. Мы использовали набор методов, описанных в данном протоколе. Модифицированный Бойден камеру количественно исследовать хемокинез из ЕЭС описано. Кроме того, использование заживления раны анализа в сочетании с анализом трека качественно оценить миграцию показано. Наконец, мы демонстрируем использование TMRM флуоресцентный краситель для исследования митохондриальной мембраны потенциала для выявления основных механизмов возмущенного миграции клеток. Следующий протокол описывает основные методы, которые были адаптированы для расследования ЕЭС.
Introduction
Миграция клеток важно во многих физиологических и патофизиологических процессах, включая развитие различных заболеваний, и заживления ран после повреждения кожи.
После травмы кожи, воспаление снимает повреждены или некротических тканей и грануляции дисководов предварительный закрытие раны и позволяет формирование сети новых капилляров через васкулогенеза (роман образование) или ангиогенез (прорастание существующих пузырьков) 1-3. Оба vasculo- и ангиогенез требует миграцию эндотелиальных клеток. Растущая сеть кровеносных сосудов необходимо транспортировать кислород и питательные вещества пролиферирующих кератиноцитов, которые, в конечном счете подвергаются кератинизации, сформировать новый эпителий и обеспечить закрытие раны.
Нарушение миграции эндотелиальных клеток основной причиной заживления раны расстройства 4,5. Таким образом, методы оценки миграции эндотелиальных клеток начале необходимо исследовать pathophysiolлогии нарушений клеточной миграции и выявить новые стратегии для терапевтического вмешательства.
Кожные воздействие алкилирующих агентов (например, серы и азота горчицы) вызывает заживление ран расстройства 6. Такие соединения были использованы в качестве боевых отравляющих веществ в несколько конфликтов в 20 веке и остается причину сильного беспокойства из-за существующих запасов в политически нестабильных регионах и относительно простым синтезом. Хотя иприт был впервые синтезирован в 1822 году, молекулярной и клинической патологии воздействия SM не понимать в деталях и не противоядие воздействия SM выявлено не было.
Несколько исследований были проведены, чтобы понять и смоделировать ухудшение заживления ран после воздействия SM и проверить потенциальных кандидатов, способных соединений резервирования, что эффект. Шмидт и др. (2009) исследовали влияние хлорамбуцилом, алкилирующего соединения со свойствами, аналогичными СМ в муSE модели эмбриоидного тела и обнаружили значительное, иногда снижение образования сосудов 7 больше, чем 99%. Этот неблагоприятный эффект наиболее выражен на этапе развития, который, в физиологических условиях, доминируют в пролиферации и миграции эндотелиальных клеток-предшественников. Таким образом, эти клетки были идентифицированы, чтобы быть особенно чувствительны к алкилирующих агентов. Steinritz и др. (2010) протестированы поглотители активных форм кислорода (АФК), в частности, N-ацетилцистеин (NAC) и альфа-линоленовой кислоты (АЛК) за их способности снижать токсичность SM в мышиных моделях эмбриоидного тела и, в частности, к восстановить образование сосудов 8. Временные защитные эффекты наблюдались, указывая, что избыточное образование АФК, вероятно, внести свой вклад в неблагоприятных эффектов СМ на заживление. Эти эффекты не являются постоянными, а два соединения-кандидаты могут быть не способны восстановить образование сосудов и заживлению ран в перспективе 8. Howeveг, эти эксперименты были проведены в сложной 3D модели, которая позволит сделал исследование миграции клеток. Таким образом, мы в дальнейшем проходят NAC и ALA для благотворного воздействия на клеточную миграцию ЕЭС, которые имеют ключевую роль в процессе формирования сосуда 9.
Кроме того, есть свидетельства, что ячейки полярность необходима для миграции клеток. Митохондриальной дисфункцией приводит к образованию активных форм кислорода было показано, ухудшает клеточной полярности и, таким образом, может неблагоприятно повлиять на миграцию клеток. Таким образом, живой клетки визуализации с учетом функции митохондрий проводили и эффекты АФК поглотители были исследованы. Следующий протокол описывает общие требования к выращиванию ЕЭС, камерный анализа Бойден, заживления ран анализа, включая анализ отслеживания клеток и использования TMRM для оценки митохондриальной функции в деталях. Важные аспекты экспериментальных протоколов для выращивания EEC и миграции будут выделены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кожные воздействие токсичных химических веществ часто приводит к тяжелым расстройством заживления ран. Основные механизмы в значительной степени неизвестны. Заживление ран представляет собой сложный процесс, который состоит из различных фаз (гемостаз, воспаление, пролиферация и рем…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
