Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
(Kükürt ve azot hardalları gibi alkilleyici kimyasal savaş ajanları dahil) kimyasal maddelere maruz kalma yara iyileşmesi bozukluğu gibi klinik belirtiler bir bolluk neden olur. Yara iyileşmesinin fizyolojik süreç oldukça karmaşıktır. Ya vaskülojenez yoluyla (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut gemilerin filizlenmesi) – granülasyon dokusu oluşumu bir ön yara kapanması ile sonuçlanan ve yeni kılcal kan damarlarının ağını sağlayan bu süreçte önemli bir adımdır. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin fonksiyonel yönelik geçiş gerektirmektedir. Böylece, erken endotel hücre (AET) göç soruşturma potansiyel terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek bozuklukları şifa kimyasal kaynaklı yara patofizyolojisi anlamak ve önemlidir.
Biz ajan poz alkilleyici sonra bozulmuş yara iyileşmesi değerlendirildi ve tr için potansiyel aday bileşikler testeatment. Bu protokolde belirtilen tekniklerin bir dizi kullanılabilir. Modifiye Boyden odası kantitatif AET'nin kemokinezinin açıklanmıştır araştırmak. Ayrıca, niteliksel göç değerlendirmek için iz analizi ile birlikte tahlil yara iyileşmesi kullanımı gösterilmiştir. Son olarak, biz rahatsız hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek için mitokondriyal membran potansiyelinin araştırılması için floresan boya TMRM kullanımını göstermek. Aşağıdaki protokol AET soruşturma için adapte edilmiş temel teknikleri anlatılmaktadır.
Introduction
Hücre göçü deri hasarı sonrasında gelişme, çeşitli hastalıklar ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde önemlidir.
Cilt hasarı takiben iltihap hasarlı veya nekrotik doku ve granülasyon sürücüleri ön yara kapanması kaldırır ve vaskülojenez yoluyla yeni kılcal bir ağ oluşumunu (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut veziküllerin filizlenme) 1-3 verir. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin göçünü gerektirir. kan damarlarının artan ağ nihai olarak keratinizasyon tabi keratinositlerin çoğalan oksijen ve besin taşımak için gerekli olan, yeni bir epitel oluşturur ve yara kapanmasını sağlar.
Endotel hücrelerinin Engelliler göç bozukluğu 4,5 yara iyileşmesi altta yatan nedenidir. Erken endotelyal hücrelerin Dolayısıyla, yöntem değerlendirmek için geçiş pathophysiol keşfetmek için gerekli olanhücre göçü bozukluklarının ogy ve terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek için.
Alkile edici maddeler (örneğin, kükürt ve azot hardalları) dermal maruz bozukluğu 6 yara iyileşme neden olur. Bu tür bileşikler nedeniyle siyasi istikrarsız bölgeler ve nispeten basit sentez mevcut stokları güçlü endişe nedeni, 20. yüzyılda çeşitli çatışmalarda kimyasal savaş maddeleri olarak kullanılan ve devam edildi. Sülfür, hardal, ilk 1822 sentezlendi rağmen, SM maruz moleküler ve klinik patoloji detaylı olarak anlaşılamamıştır SM maruz kalma bir antidot saptanmıştır.
Pek çok çalışma, anlamak ve SM maruz kaldıktan sonra bozuk yara iyileşmesi model ve bu etki ayırma yeteneğine potansiyel aday bileşikler test etmek için gerçekleştirilmiştir. Schmidt ve ark. (2009), klorambusil etkisini MM SM benzer özelliklere sahip bir alkilleme bileşiği testse embriyoid vücut modelleri ve damar oluşumunda 7 dramatik, bazen% 99'dan fazla azalma bulundu. Bu olumsuz etki, en, fizyolojik koşullar altında, proliferasyon ve vasküler endotel öncü hücrelerin göç hakim olduğu bir gelişme aşamasında belirgindir. Bu nedenle, bu hücreler, alkile edici maddeler, özellikle duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Steinritz ve ark., (2010), fare embriyoit vücut modellerinde ve özellikle SM toksisitesini azaltmak için yetenekleri açısından özellikle, N-asetilsistein (NAC), ve alfa linolenik asit (ALA), reaktif oksijen türlerinin (ROS), temizleyicileridir test damar oluşumunu 8 geri yükleme. Geçici koruyucu etkilerinin aşırı ROS oluşumu yara iyileşmesi üzerine SM olumsuz etkilerine katkıda muhtemel olduğunu belirten gözlendi. Bu etkiler kalıcı değildir ve iki aday bileşikler, uzun vadede 8 damar oluşumu ve yara iyileşmesini geri yeteneğine sahip olmayabilir. However, bu deneyler, hücre göçü soruşturma izin vermedi karmaşık bir 3D modelinde yürütülmüştür. Böylece, sonradan damar oluşumu 9 sürecinde önemli bir role sahip EEC hücre göçü üzerindeki yararlı etkileri NAC ve ALA test edilmiştir.
Ayrıca, hücre kutup hücre göçü için gerekli olduğunu kanıtlar vardır. ROS oluşumuna yol açan Mitokondriyal işlev bozukluğu, hücre polarite bozduğu gösterilmiştir ve bu nedenle olumsuz hücre göçü etkileyebilir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon açısından canlı hücre görüntüleme uygulandı ve ROS temizleyicilerin etkileri incelenmiştir. Aşağıdaki protokol EEC, Boyden odasının deneyi, hücre izleme analizleri ayrıntılı olarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için TMRM kullanımı dahil olmak üzere deney yara iyileşmesi kültivasyonu için genel şartları tarif eder. AET ekimi ve göç için deneysel protokollerin önemli yönleri vurgulanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zehirli kimyasallara dermal maruziyet sık sık şiddetli yara iyileşmesi bozukluğu ile sonuçlanır. altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Yara iyileşmesi farklı aşamalardan (hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme) oluşan karmaşık bir süreçtir. Hücre göçü, ancak, bu granülasyon dokusunun oluşması için büyük önem taşımaktadır, her aşamada yer almaktadır. Burada, yeni kan damarlarının anjiyo- veya vaskülojenez yoluyla oluşturulur.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
