Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
Blootstelling aan chemische stoffen (met inbegrip van alkylerende chemische strijdmiddelen zoals zwavel en stikstof mosterd) veroorzaken een overvloed aan klinische symptomen, waaronder wondgenezing stoornis. De fysiologische proces van wondgenezing is zeer complex. De vorming van granulatieweefsel is een belangrijke stap in dit proces resulteert in een eerste wondsluiting en leveren van een netwerk van nieuwe capillaire bloedvaatjes – hetzij door vasculogenese (novel vorming) of angiogenese (ontspruiten van bestaande schepen). Zowel vasculo- en angiogenese vereisen een functionele, geregisseerd migratie van endotheelcellen. Aldus onderzoek vroege endotheelcellen (EEG) migratie van belang de pathofysiologie van chemische geïnduceerde aandoeningen wondgenezende begrijpen en om potentieel nieuwe strategieën te identificeren voor therapeutische interventie.
We beoordeeld verstoorde wondgenezing na alkylerende blootstelling middel en getest potentiële kandidaat-verbindingen voor treatment. We gebruikten een reeks technieken die in dit protocol. Een gewijzigde Boyden kamer om kwantitatief onderzoek chemokinesis van EEG wordt beschreven. Bovendien wordt het gebruik van de wondgenezende assay in combinatie met track analyse kwalitatieve evaluatie migratie toegelicht. Tenslotte tonen we het gebruik van de fluorescente kleurstof TMRM voor het onderzoeken van mitochondriale membraanpotentiaal onderliggende mechanismen van verstoorde celmigratie identificeren. Het volgende protocol beschrijft de basistechnieken die zijn aangepast voor het onderzoek van de EEG.
Introduction
Celmigratie is belangrijk in vele fysiologische en pathofysiologische processen zoals ontwikkeling, verschillende ziekten, en wondheling bij huidletsel.
Na de huid letsel, ontsteking verwijdert beschadigd of necrotische weefsel en granulatie drives voorlopige wond sluiting en maakt de vorming van een netwerk van nieuwe haarvaten door middel vasculogenese (roman vorming) of angiogenese (kiemen van bestaande blaasjes) 1-3. Zowel vasculo- en angiogenese vereisen migratie van endotheelcellen. De groeiende netwerk van bloedvaten is essentieel om zuurstof en voedingsstoffen transporteren naar prolifererende keratinocyten die uiteindelijk ondergaan keratinisatie, vormen een nieuw epitheel en bieden wondsluiting.
Verminderde migratie van endotheliale cellen is een onderliggende oorzaak van wondgenezende stoornis 4,5. Aldus methoden te beoordelen migratie van endotheelcellen vroege moeten de pathophysiol verkennengie van celmigratie aandoeningen en om nieuwe strategieën te identificeren voor therapeutische interventie.
Dermale blootstelling aan alkylerende middelen (bijvoorbeeld zwavel en stikstof mosterds) veroorzaakt wondgenezende aandoening 6. Dergelijke verbindingen werden gebruikt als chemische oorlogsvoering agenten in verschillende conflicten in de 20e eeuw en blijft reden voor grote bezorgdheid als gevolg van de bestaande voorraden in politiek instabiele regio's en de relatief eenvoudige synthese. Hoewel zwavelmosterd eerst werd gesynthetiseerd in 1822, is de moleculaire en klinische pathologie van SM blootstelling niet begrepen in detail en geen antidotum voor SM blootstelling is geïdentificeerd.
Verschillende studies zijn uitgevoerd om te begrijpen en te modelleren vertraagde wondgenezing na blootstelling SM en te testen op potentiële kandidaat-verbindingen kunnen reserveren daartoe. Schmidt et al. (2009) het effect van chloorambucil, een alkyleringsverbinding met eigenschappen vergelijkbaar met SM in mou getestse embryoid body modellen en vond een dramatische, soms meer dan 99% verlaging van vat 7. Dit nadelige effect is het meest uitgesproken in een ontwikkelingsstadium dat onder fysiologische omstandigheden wordt gedomineerd door de proliferatie en migratie van vasculaire endotheliale voorlopercellen. Aldus werden deze cellen geïdentificeerd bijzonder gevoelig alkyleringsmiddelen zijn. Steinritz et al. (2010) testte vangers van reactieve zuurstof species (ROS), in het bijzonder N-acetylcysteïne (NAC) en alfa-linoleenzuur (ALA) op hun vermogen SM toxiciteit verminderen muizen embryoiden lichaam modellen en met name herstellen bloedvatvorming 8. Tijdelijke beschermende effecten werden waargenomen, wat aangeeft dat overmatige ROS formatie kunnen bijdragen tot de nadelige effecten van SM op wondgenezing. Deze effecten waren niet permanent en de twee kandidaat-verbindingen niet kunnen herstellen vat en wondgenezing op lange termijn 8 zijn. However, die experimenten werden uitgevoerd in een complexe 3D model dat toeliet onderzoeken celmigratie. Zo hebben we vervolgens getest NAC en ALA voor gunstige effecten op celmigratie van EEG die een belangrijke rol in het proces van het vat 9 heeft.
Bovendien zijn er aanwijzingen dat celpolariteit nodig is voor celmigratie. Mitochondriale dysfunctie wat leidt tot de vorming van ROS werd aangetoond dat celpolariteit schaden en kan dus nadelig beïnvloeden celmigratie. Daarom live cell imaging wat mitochondriale functie werd uitgevoerd en de effecten van ROS scavengers onderzocht. Het volgende protocol beschrijft de algemene eisen voor de teelt van de EEG, de Boyden kamer assay, de wondgenezing assay waaronder cell tracking-analyse en het gebruik van TMRM voor de beoordeling van de mitochondriale functie in detail. Belangrijke aspecten van de experimentele protocollen voor EEG teelt en migratie worden gemarkeerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dermale blootstelling aan giftige chemische stoffen resulteert vaak in ernstige wondgenezing stoornis. De onderliggende mechanismen zijn grotendeels onbekend. Wondgenezing is een complex proces dat uit verschillende fasen (hemostase, inflammatie, proliferatie en hermodellering). Celmigratie is betrokken bij elke fase, is het echter van het grootste belang voor de vorming van granulatieweefsel. Hier worden nieuwe bloedvaten ofwel gevormd door angio of vasculogenese.
Beide werkwijzen vereisen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
