Vurdering af endotelcellemigration Efter eksponering for giftige kemikalier
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
Udsættelse for kemiske stoffer (herunder alkylerende kemiske kampstoffer som svovl og nitrogensennepper) forårsage en overflod af kliniske symptomer, herunder sårhelingslidelse. Den fysiologiske proces med sårheling er meget kompleks. Dannelsen af granulationsvæv er et vigtigt skridt i denne proces resulterer i en foreløbig sår lukning og give et netværk af nye skibe kapillære blod – enten gennem vaskulogenese (roman dannelse) eller angiogenese (spiring af eksisterende fartøjer). Både vasculo- og angiogenese kræver en funktionel, dirigeret migration af endotelceller. Således undersøgelse af tidlig endotelcelle (EØF) migration er vigtigt at forstå patofysiologien af kemisk påført sårhelende lidelser og potentielt identificere nye strategier for terapeutisk intervention.
Vi vurderede forringet sårheling efter alkylerende middel eksponering og testet potentielle kandidatlande forbindelser til treatment. Vi brugte et sæt af teknikker, der er skitseret i denne protokol. En modificeret Boyden kammer til kvantitativt undersøge kemokinese af EØF beskrives. Desuden er anvendelsen af den sårhelende assayet i kombination med spor analyse til kvalitativ evaluering migration illustreret. Endelig har vi demonstrere brugen af det fluorescerende farvestof TMRM for undersøgelse af mitochondriemembranpotential at identificere underliggende mekanismer forstyrret cellemigrering. Følgende protokol beskriver de grundlæggende teknikker, som er blevet tilpasset til undersøgelse af EØF.
Introduction
Cellemigrering er vigtig i mange fysiologiske og patofysiologiske processer, herunder udvikling, forskellige sygdomme og sårheling efter hudbeskadigelse.
Efter hud skade, betændelse fjerner beskadigede eller nekrotisk væv og granulering drev foreløbig sårlukning og tillader dannelse af et netværk af nye kapillærer gennem vaskulogenese (roman dannelse) eller angiogenese (spiring af eksisterende vesikler) 1-3. Både vasculo- og angiogenese kræver migration af endotelceller. Den voksende netværk af blodkar er afgørende for at transportere ilt og næringsstoffer til prolifererende keratinocytter som i sidste ende undergår keratinisering, danne et nyt epitel og give sårlukning.
Nedsat migration af endotelceller er en underliggende årsag til sårhelingslidelse 4,5. Således fremgangsmåder vurdere migration af tidlige endotelceller skal udforske pathophysiolnologi lidelser celle migration og at identificere nye strategier for terapeutisk intervention.
Hudeksponering for alkyleringsmidler (fx svovl og nitrogensennepper) forårsager sårhelingslidelse 6. Sådanne forbindelser blev brugt som kemisk kampstoffer i flere konflikter i det 20. århundrede og forbliver grund til stor bekymring på grund af de eksisterende lagre i politisk ustabile regioner og den relativt simple syntese. Selvom svovl sennep først blev syntetiseret i 1822, er den molekylære og kliniske patologi SM eksponering ikke forstået i detaljer, og ingen modgift mod SM eksponering er blevet identificeret.
Adskillige undersøgelser er blevet gennemført for at forstå og modellere forringet sårheling efter SM eksponering og til at teste for potentielle kandidatlande forbindelser, der kan forbeholde denne virkning. Schmidt et al. (2009) testede virkningen af chlorambucil, et alkylerende forbindelse med egenskaber svarende til SM i mouSE embryoid krop modeller og fundet en dramatisk, til tider mere end 99% reduktion i beholder formation 7. Denne negative effekt var mest udtalt på et udviklingstrin, som under fysiologiske betingelser, er domineret af proliferation og migration af vaskulære endotel præcursorceller. Således blev disse celler identificeret til at være særligt følsomme over for alkyleringsmidler. Steinritz et al. (2010) testede skyllevæsker af reaktive oxygen species (ROS), især N-acetylcystein (NAC) og alfa-linolensyre (ALA) for deres evne til at reducere SM toksicitet i mus embryoid body modeller og især til genoprette dannelse beholderen 8. Midlertidige beskyttende virkninger blev observeret, hvilket indikerer, at overdreven ROS-dannelse var sandsynligvis bidrage til de negative virkninger af SM på sårheling. Disse virkninger var ikke permanent, og de to kandidatforbindelser kan ikke være i stand til at genoprette dannelse fartøj og sårheling på lang sigt 8. However, blev disse eksperimenter udført i en kompleks 3D-model, der tillod undersøgelse af celle migration. Således har vi efterfølgende testet NAC og ALA til gavnlige virkninger på celle migration af EØF, der har en central rolle i processen med fartøjets dannelse 9.
Desuden er der tegn på, at cellepolaritet er påkrævet for cellemigrering. Mitokondriel dysfunktion fører til ROS-dannelse blev vist at forringe celle polaritet og kan således påvirke celle migration. Derfor blev levende celler med hensyn til mitokondrisk funktion, der udføres, og virkningerne af ROS skyllevæsker blev undersøgt. Følgende protokol beskriver generelle krav til dyrkning af EØF Boyden kammer analysen, at sårheling analysen herunder celle sporing analyse og brug af TMRM til vurdering af mitokondriefunktion i detaljer. Vigtige aspekter af forsøgsprotokoller for EØF dyrkning og migration er fremhævet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dermal eksponering for giftige kemikalier ofte resulterer i alvorlige sårheling lidelse. De underliggende mekanismer er stort set ukendte. Sårheling er en kompleks proces, som består af forskellige faser (hæmostase, inflammation, proliferation og remodeling). Cellemigrering er involveret i hver fase, men det er af største betydning for dannelsen af granulationsvæv. Her bliver nye blodkar dannes enten af angio- eller vaskulogenese.
Begge processer kræver upåvirket migratio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
