Hepatocyt-specifik Ablation i Zebrafisk til Studieinformationen Biliær drevet Liver Regeneration
Summary
To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Abstract
Leveren har en stor evne til at regenerere. Hepatocytter de parenchymale celler i leveren, kan regenerere på en af to måder: hepatocyte- eller biliær-driven leverregenerering. I hepatocyt-drevet lever regenerering er regenererende hepatocytter stammer fra allerede eksisterende hepatocytter, der henviser til, galde-drevet regeneration, er regenererende hepatocytter stammer fra biliære epithelceller (BECs). For hepatocyt-drevet lever regenerering, der er fremragende gnaver modeller, der har bidraget væsentligt til den nuværende forståelse af liver regenerering. Findes ingen sådan gnavermodel men for galde-drevne liver regenerering. Vi har for nylig rapporteret om en zebrafisk leverskade model, hvor BECs udstrakt give anledning til hepatocytter ved alvorlig hepatocyt tab. I denne model er hepatocytter specifikt ablateres af en farmakogenetiske midler. Her præsenterer vi i detaljer metoder til at ablatere hepatocytter og analysere BEC-drevne lever regenereringsproces.Denne hepatocyt-specifikke ablation model kan yderligere bruges til at opdage de underliggende molekylære og cellulære mekanismer galde-drevne liver regenerering. Endvidere kan anvendes disse metoder til kemiske screeninger til identifikation af små molekyler, som styrker eller undertrykker leverregenerering.
Introduction
Leveren er et meget regenerativ organ. Under leverregenerering, regenererende hepatocytter, de parenchymale celler i leveren, er afledt af allerede eksisterende hepatocytter (hepatocyt-driven leverregenerering) eller BECs (galde-driven leverregenerering) 1,2. Leverskader normalt fremkalder spredning af allerede eksisterende hepatocytter; men når hepatocytproliferation er kompromitteret, kan BECs bidrage til hepatocytter 2-4. Disse to former for leverregenerering er klinisk signifikant. Efter kirurgisk fjernelse af en del af den humane lever (f.eks på grund af levertumorer og levende lever donorer), hepatocytter i leveren resterende prolifererer at genvinde det tabte leveren masse. Derimod hos patienter med alvorlige leversygdomme, hepatocytproliferation er stærkt kompromitteret, så BECs eller lever progenitorceller (LPCs) synes at bidrage til regenererende hepatocytter 5,6. Gnaveren 2/3 partiel hepatektomi model, hvorhepatocytter formere at genvinde den tabte leveren masse, væsentligt har bidraget til den nuværende forståelse af hepatocyt-drevne liver regenerering 7,8. Der er imidlertid ingen gyldig gnaver model, hvor regenererende hepatocytter hovedsageligt afledt af BECs. Selv om flere gnaver lever toksin modeller førte til identifikation af galde-driven leverregenerering 2-4, seneste afstamningsceller opsporing undersøgelser i mus indikerer en minimal bidrag BECs til regenererende hepatocytter i disse modeller 9,10. Nogle af de gnaver leverskade modeller, herunder partiel hepatektomi 11-13 og acetaminophen-induceret leverskade 14,15, er blevet anvendt på zebrafisk og førte til identifikation af hidtil ukendte gener eller veje impliceret i leverregenerering. Imidlertid hepatocyt-drevet, men ikke BEC-drevet, forekommer leverregenerering i disse zebrafisk leverskader modeller. Derfor er en ny leverskade model, hvor BECs udstrakt bidrage til regenerating hepatocytter er nødvendig for en bedre forståelse af BEC-drevne liver regenerering.
De overordnede mål for hepatocyt ablation modellen beskrevet her, er (1) til at generere en leverskade model, hvor BECs udstrakt bidrage til regenererende hepatocytter, og (2) belyse de molekylære og cellulære mekanismer bag BEC-drevet liver regenerering. Vi antager, at alvoren af skaden bestemmer tilstanden af lever regenerering; Således har vi forudså, at galde-driven leverregenerering vil initiere ved alvorlig hepatocyt skade. For at teste denne hypotese, udviklede vi en zebrafisk leverskade model ved at generere en transgen linie, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, at stærkt udtrykker bakteriel nitroreduktase (NTR) fusioneret med cyan fluorescerende protein (CFP) under hepatocyt-specifik fabp10a promotoren. Siden NTR omdanner ikke-toksisk prodrug, metronidazol (Mtz) til et cytotoksisk lægemiddel, det ablaterer kun den planlagte NTR-udtrykkende celler 16-18, i dette tilfælde, hepatocytterne. Ved at manipulere varighed Mtz behandling, kan omfanget af hepatocyt ablation styres. Ved hjælp af denne model, vi for nylig rapporteret, at efter alvorlige hepatocyt tab, BECs udstrakt give anledning til regenererende hepatocytter 19, som blev yderligere bekræftet af to andre uafhængige undersøgelser 20,21. Derfor, sammenlignet med den førnævnte gnaver og zebrafisk leverskader modeller, vores hepatocyt ablation model er mere fordelagtig til at studere BEC-drevet leverregenerering.
Denne protokol beskriver proceduren for at udføre liver regenerering eksperimenter ved hjælp af zebrafisk hepatocyt ablation model. Denne model vil være passende til at bestemme mekanismerne bag galde-drevet lever regenerering og til kemiske skærme at identificere små molekyler, der kan undertrykke eller forøge lever regenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alvorlige, men ikke mild, hepatocyt ablation fremkalder galde-drevet leverregenerering. Derfor følgende Mtz behandling og udvaskning, er det vigtigt at undersøge leveren størrelse Mtz-behandlede larver, der kan vurderes ved iboende FFP fluorescens fra fabp10a: CFP-NTR transgen. Da en lille procentdel af Mtz-behandlede larver vil vise ikke-ablateret (0-5%) eller delvist ablated (10-20%) lever, er det vigtigt at sortere og kun analysere larver med en meget lille leveren, som indikerer alvorlig hepatocyt ablati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
Materials
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte ‘buds’ in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. 발생학. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
