Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

Summary

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Abstract

Le foie a une grande capacité à se régénérer. Les hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, peut régénérer en une de deux manières: ou conduit biliaire hepatocyte–régénération du foie. Dans entraîné hépatocytes la régénération du foie, régénération des hépatocytes sont dérivés d'hépatocytes préexistantes, alors que, dans la régénération conduit biliaire, de régénération des hépatocytes sont dérivées de cellules epitheliales biliaires (BEC). Pour entraîné hépatocytes la régénération du foie, il ya d'excellents modèles de rongeurs qui ont contribué de manière significative à la compréhension actuelle de la régénération du foie. Cependant, rien de tel modèle de rongeur existe pour entraînée bilio-régénération du foie. Nous avons récemment rapporté sur un modèle de blessure de foie de poisson zèbre dans lequel BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes sur une perte sévère des hépatocytes. Dans ce modèle, les hépatocytes sont spécifiquement ablation par un moyen pharmacogénétiques. Ici, nous présentons en détail les méthodes pour l'ablation des hépatocytes et d'analyser le processus de régénération du foie BEC-driven.Ce modèle d'ablation spécifiques hépatocytes peut encore être utilisé pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents de conduit biliaire-régénération du foie. En outre, ces méthodes peuvent être appliquées à des écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui inhibent ou augmentent la régénération du foie.

Introduction

Le foie est un organe très régénérative. Au cours de la régénération du foie, régénération des hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, sont dérivés des hépatocytes pré-existantes (entraînée hépatocytes régénération du foie (BEC) ou entraîné biliaire de régénération du foie) ^1,2. Des lésions hépatiques suscite habituellement la prolifération des hépatocytes pré-existante; cependant, lorsque la prolifération des hépatocytes est compromise, BEC peut contribuer à hépatocytes ^2-4. Ces deux modes de régénération du foie sont cliniquement significatives. Après l'ablation chirurgicale d'une partie du foie humain (par exemple, en raison de tumeurs du foie ou des donneurs vivants de foie), les hépatocytes dans le foie restant prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu. En revanche, chez des patients atteints de maladies hépatiques graves, la prolifération des hépatocytes est fortement compromise, de sorte que BEC ou de cellules souches du foie (LPC) semblent contribuer à la régénération des hépatocytes ^5,6. Le modèle de hépatectomie partielle rongeurs 2/3, dans lequelhépatocytes prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu, a largement contribué à la compréhension actuelle de entraîné hépatocytes de foie de régénération ^7,8. Cependant, il n'y a pas modèle de rongeur valide dans lequel les hépatocytes régénération proviennent principalement de BEC. Bien que plusieurs modèles de rongeurs de la toxine du foie ont conduit à l'identification de conduit biliaire du foie régénération ^2-4, des études récentes de la lignée de traçage chez les souris indiquent une contribution minimale de BEC pour la régénération des hépatocytes dans ces modèles ^9,10. Certains des modèles de lésions hépatiques de rongeurs, y compris une hépatectomie partielle et induite par l'acétaminophène ^11-13-14,15 dommages au foie, ont été appliquées pour le poisson zèbre et conduit à l'identification de nouveaux gènes ou des voies impliquées dans la régénération du foie. Cependant, les hépatocytes entraînée, mais pas BEC-entraînée, la régénération du foie se produit dans ces modèles de lésion du foie de poisson zèbre. Par conséquent, un modèle de lésion du foie roman dans lequel CAE contribuent largement à regenerating hépatocytes est nécessaire pour une meilleure compréhension du BEC-entraîné la régénération du foie.

Les objectifs globaux du modèle d'ablation des hépatocytes décrits ici sont (1) pour générer un modèle de lésion du foie dans laquelle CAE contribuent largement aux hépatocytes de régénération, et (2) élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents BEC-driven la régénération du foie. Nous émettons l'hypothèse que la gravité des blessures détermine le mode de régénération du foie; ainsi, nous avons prédit que conduit biliaire-régénération du foie lancerait lors d'une lésion des hépatocytes sévère. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé un modèle de lésion du foie de poisson zèbre en générant une lignée transgénique, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^S931, qui exprime très nitroreductase bactérienne (NTR) fusionnée avec une protéine fluorescente cyan (CFP) dans le cadre du fabp10a spécifique hépatocytes promoteur. Depuis NTR convertit le promédicament non toxique, le métronidazole (Mtz), en un médicament cytotoxique, il ne l'ablation destiné NTR-cellules exprimant ^16-18, dans ce cas, les hépatocytes. En manipulant la durée du traitement Mtz, l'étendue des hépatocytes ablation peut être contrôlée. En utilisant ce modèle, nous avons récemment signalé que sur une perte sévère des hépatocytes, BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes régénération ^19, qui a été confirmée par deux autres études indépendantes ^20,21. Par conséquent, par rapport à l'rongeur ci-dessus et les modèles de lésions du foie de poisson zèbre, notre modèle d'ablation des hépatocytes est plus avantageux pour l'étude BEC-driven la régénération du foie.

Ce protocole décrit la procédure pour effectuer des expériences de régénération du foie en utilisant le modèle hépatocytes d'ablation poisson zèbre. Ce modèle sera appropriée pour déterminer les mécanismes sous-jacents conduit biliaire-régénération du foie et pour les écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui peuvent réprimer ou d'augmenter la régénération du foie.

Protocol

Poisson zèbre ont été soulevées et élevés selon la procédure standard; expériences ont été approuvés par l'Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité. 1. Préparation d'embryons / larves Pour mener accouplements chronométrés, mis en place adulte mâle et femelle Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931 poissons hémizygotes ou homozygotes O / N et placer une séparation entre eux. Retirer ce diviseur l…

Representative Results

Mtz traitement pendant 36 heures (A36h, A représente ablation) de 3,5 à 5 dpf réduit considérablement la taille du foie (figure 1B). Après Mtz lavage, considéré comme le début de la régénération du foie (R), forte fabp10a: CFP-NTR et fabp10a: expression DsRed réapparu dans les 30 heures (figure 1B). Le réseau des voies biliaires intra-hépatique, tel qu'évalué par l'expression de Alcam qui est présente dans la membrane du BEC 22, d&#3…

Discussion

Sévère, mais pas doux, hépatocytes ablation suscite conduit biliaire-régénération du foie. Par conséquent, après un traitement Mtz et lavage, il est important d'examiner la taille du foie de la larve Mtz-traité, qui peut être évaluée par fluorescence intrinsèque de la PCP fabp10a: CFP-NTR transgène. Comme un faible pourcentage de larves traitées Mtz affiche non-ablatée (0-5%) ou partiellement ablation (10-20%) des foies, il est essentiel de régler et d'analyser seulement les larves avec…

Materials

3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Mounting media (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
clear nail polish	Fisher Scientific	50949071
fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
glass slide	Fisher Scientific	12-544-1
glass coverslip	Fisher Scientific	12-540-A and 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (mouse anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 dilution
goat anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 dilution
rat anti-RFP	Allele Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	1:500 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 dilution
Cy3 donkey anti-rat IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 dilution
dissecting microscope	Leica Microsystems	S6F
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA
confocal microscope	Carl Zeiss	LSM700
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
10X PBS			25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.  Bring to 1 L with distilled water.  Adjust pH 7.  Autoclave for 20 min at 121°C.
1X PBSDT			0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.
PEM buffer			30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Bring to 1 L with distilled water.  Adjust pH 7.
Blocking solution			Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.