胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション
Summary
To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Abstract
肝臓は再生する素晴らしい能力を持っています。 hepatocyte-または胆管駆動の肝再生：肝細胞、肝臓の実質細胞は、次のいずれかの方法で再生することができます。胆管駆動の再生に、再生肝細胞は、胆管上皮細胞（BECS）から誘導され、一方、肝細胞主導の肝再生においては、再生肝細胞は、既存の肝細胞に由来します。肝細胞主導の肝臓再生のために、大幅に肝再生の現在の理解に貢献した優れたげっ歯類モデルがあります。しかし、そのようなげっ歯類モデルは胆汁駆動型肝再生のために存在しません。私たちは最近、BECSが広く重度の肝細胞の喪失時の肝細胞を生じさせているゼブラフィッシュの肝障害モデルについて報告しました。このモデルでは、肝細胞を特異的薬理遺伝学的手段によって切除されています。ここでは、肝細胞を切除するとBEC主導の肝再生過程を分析するために、詳細に方法を提示します。この肝細胞特異的切除モデルは、さらに胆汁ドリブン肝再生の基礎となる分子及び細胞メカニズムを発見するために使用することができます。さらに、これらの方法は、肝再生を増強または抑制する小分子を同定するために、化学的スクリーニングに適用することができます。
Introduction
肝臓は非常に再生器官です。肝臓再生中に、肝細胞の再生、肝臓の実質細胞は、既存の肝細胞（肝細胞ドリブン肝再生）またはBECS（胆汁ドリブン肝再生）1,2から誘導されます。肝臓損傷は、通常、既存の肝細胞の増殖を誘発します。肝細胞増殖が損なわれたときただし、BECS 2-4を肝細胞に寄与することができます。肝再生のこれらの2つのモードは、臨床的に重要です。 （理由肝腫瘍やライブ肝ドナーの例えば ）ヒト肝臓の一部を外科的に除去すると、残りの肝臓における肝細胞は、失われた肝臓塊を回復するために増殖します。 BECSまたは肝臓前駆細胞（たLPC）は、肝細胞の再生5,6に寄与するように見えるように対照的に、重篤な肝疾患を有する患者において、肝細胞増殖が大きく損なわれる。げっ歯類2/3部分肝切除モデル、中肝細胞は有意に肝細胞主導の肝再生7,8の現在の理解に貢献してきました、失われた肝臓塊を回復するために増殖します。しかし、再生肝細胞は、主にBECSに由来する有効なげっ歯類モデルはありません。いくつかのげっ歯類の肝臓毒素モデルは胆道駆動型肝再生2-4の同定をもたらしたが、マウスにおける最近の系譜トレースの研究では、これらのモデル9,10に肝細胞の再生にBECSの最小の寄与を示しています。部分肝切除11-13とアセトアミノフェン誘発性肝障害14,15を含むげっ歯類の肝障害モデルのいくつかは、ゼブラフィッシュに適用され、肝臓再生に関与する新規遺伝子または経路の同定につながってきました。しかし、肝細胞主導型ではなく、BECドリブン、肝再生は、これらのゼブラフィッシュの肝障害モデルで発生します。したがって、新規な肝臓損傷モデルとは、BECSは広くregeneratに寄与します肝細胞をるがBEC主導の肝再生のよりよい理解のために必要とされます。
ここで説明肝切除モデルの全体的な目標は、（1）BECSは広範囲の肝細胞の再生に寄与し、そして（2）BECドリブン肝再生の基礎となる分子及び細胞メカニズムを解明した肝損傷モデルを生成することです。私たちは、損傷の重症度は、肝臓再生のモードを決定するという仮説を立てました。このように、我々は、胆管駆動の肝再生が厳しい肝細胞傷害の際に開始するだろうと予測しました。この仮説を検証するため、我々はトランスジェニック系統を生成することにより、ゼブラフィッシュの肝臓損傷モデルを開発し、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）S931は 、ことは非常に肝細胞特異的fabp10a下シアン蛍光タンパク質（CFP）と融合した細菌ニトロレダクターゼ（NTR）を発現しますプロモーター。 NTRは、非毒性のプロドラッグを変換するので、メトロニダゾール（MTZ）は、細胞傷害性薬物に、それだけで意図アブレーションNTR-この場合、16-18肝細胞発現細胞。 MTZ治療の持続時間を操作することによって、肝切除の程度を制御することができます。このモデルを使用して、我々は最近、重度の肝細胞の喪失時に、BECSは広く、さらに他の二つの独立した研究20,21によって確認された肝細胞19を 、再生を生じさせることを報告しました。したがって、上記の齧歯類及びゼブラフィッシュ肝臓損傷モデルと比較して、我々の肝切除モデルはBEC駆動型肝再生を研究するため、より有利です。
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ肝切除モデルを用いて、肝再生の実験を行うための手順を記載しています。このモデルは、胆汁駆動型肝再生のメカニズムを決定するための、および化学スクリーンが抑制または肝再生を増強することができる小分子を同定するために適切です。
Protocol
Representative Results
Discussion
重度、軽度ではない、肝切除は、胆管駆動の肝臓の再生を誘発します。 CFP-NTR導入遺伝子：したがって、MTZの治療およびウォッシュアウトの後、それはfabp10aから固有のCFPの蛍光によって評価することができるMTZ処理した幼虫の肝臓サイズを調べることが重要です。 MTZ処理した幼虫の小さな割合は、非アブレーション表示（0-5％）または（10〜20％）の肝臓の一部アブレー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
Materials
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte ‘buds’ in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. 발생학. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
