אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה
Summary
To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Abstract
יש כבד קיבולת גדולה להתחדש. Hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, יכול להתחדש באחת משתי דרכים: התחדשות כבד hepatocyte- או מונע מרה. בהתחדשות כבד מונע hepatocyte, hepatocytes התחדשות נגזרים מhepatocytes preexisting, ואילו, בהתחדשות מונעת מרה, hepatocytes התחדשות נגזרים מתאי אפיתל מרה (BECs). להתחדשות כבד מונע hepatocyte, יש מודלים של מכרסמים מצוינים שתרמו באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד. עם זאת, אין מודל מכרסם כזה קיים להתחדשות כבד מונע מרה. אנחנו דיווחו לאחרונה על מודל פגיעה בכבד דג הזברה שבBECs הרחבה להצמיח hepatocytes על אובדן hepatocyte חמור. במודל זה, hepatocytes הם ablated במיוחד על ידי אמצעי pharmacogenetic. כאן אנו מציגים בפירוט את השיטות ללקטוע hepatocytes ולנתח את תהליך ההתחדשות הכבד מונע-BEC.מודל אבלציה hepatocyte ספציפי זה יכול לשמש נוסף כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים ותאיים הבסיסיים של התחדשות כבד מונע מרה. יתר על כן, יכול להיות מיושמות בשיטות אלה למסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שלהגדיל או לדכא התחדשות כבד.
Introduction
הכבד הוא איבר משובי מאוד. במהלך התחדשות כבד, התחדשות hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, נגזרים מhepatocytes קיים מראש (התחדשות כבד מונע hepatocyte) או BECs (התחדשות כבד מונע מרה) 1,2. פגיעה בכבד בדרך כלל מעוררת את ההתפשטות של hepatocytes קיים מראש; עם זאת, כאשר התפשטות hepatocyte נפגעת, BECs יכולה לתרום לhepatocytes 2-4. שני מצבים אלה של התחדשות כבד הם משמעותיים מבחינה קלינית. לאחר ההסרה כירורגית של חלק מהכבד האנושי (למשל, בגלל גידולים בכבדים או תורמים כבד חיים), hepatocytes בכבד שנותר להתרבות כדי לשחזר את מסת כבד לאיבוד. לעומת זאת, בחולים עם מחלות כבד חמורות, התפשטות hepatocyte נפגעת מאוד, כך שBECs או תאי כבד (LPCs) מופיעות לתרום לhepatocytes התחדשות 5,6. מודל כריתה החלקי המכרסמים 2/3, שבhepatocytes להתרבות כדי לשחזר את המסה הכבד איבדה, תרם באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד מונע hepatocyte 7,8. עם זאת, אין מודל מכרסם בתוקף שבhepatocytes התחדשות נגזרים בעיקר מBECs. למרות שכמה דגמי רעלן כבד מכרסמים הובילו לזיהוי של התחדשות כבד מונע מרה 2-4, מחקרי שושלת ההתחקות אחרונים בעכברים מצביעים תרומה מינימאלית של BECs להתחדשות hepatocytes במודלים אלה 9,10. חלק מדגמי הפגיעה בכבד מכרסמים, כולל כריתה חלקית 11-13 ונזק כבד נגרם פרצטמול 14,15, יושמו לדג זברה והוביל לזיהוי של גנים חדשים או מסלולים מעורבים בהתחדשות כבד. עם זאת, המונע על ידי hepatocyte, אבל לא מונע-BEC, התחדשות כבד מתרחשת בדגמי פגיעה בכבד דג הזברה אלה. לכן, מודל פגיעה בכבד רומן שבי BECs הרחבה לתרום לregenerating hepatocytes נחוץ להבנה טובה יותר של התחדשות כבד מונעת-BEC.
מטרות העל של מודל אבלציה hepatocyte מתואר כאן (1) כדי ליצור מודל פגיעה בכבד שבי BECs נרחבת תורם להתחדשות תאים כבדות, ו- (2) להבהיר את המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התחדשות כבד מונעת-BEC. חוקרים שערנו כי חומרת פגיעה קובעת את המצב של התחדשות כבד; כך, אנו חוזים כי התחדשות כבד מונע מרה תיזום על פציעת hepatocyte חמורה. כדי לבדוק השערה זו, פיתחנו מודל פגיעה בכבד דג הזברה על ידי יצירת קו מהונדס, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, שמאוד מבטא Nitroreductase חיידקים (NTR) התמזגה עם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) תחת fabp10a hepatocyte הספציפי אמרגן. מאז NTR ממיר את prodrug אינה רעילה, metronidazole (Mtz), לתרופה רעילה לתאים, זה ablates רק נועד NTR-לבטא בתאים 16-18, במקרה זה, hepatocytes. על ידי מניפולציה של משך טיפול Mtz, היקף אבלציה hepatocyte יכול להיות נשלט. שימוש במודל זה, שדיווחנו לאחרונה כי על אובדן hepatocyte חמור, BECs הרחבה להצמיח hepatocytes התחדשות 19, אשר אושר עוד יותר על ידי שני מחקרים עצמאיים אחרים 20,21. לכן, בהשוואה למכרסמים האמורים ודגמי פגיעה בכבד דג הזברה, מודל אבלציה hepatocyte שלנו הוא יתרון נוסף ללימוד התחדשות כבד מונעת-BEC.
פרוטוקול זה מתאר את ההליך לביצוע ניסויי התחדשות כבד באמצעות מודל אבלציה hepatocyte דג הזברה. מודל זה יהיה מתאים לקביעת מנגנוני התחדשות כבד מונע מרה ולמסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שיכול להדחיק או להגדיל את ההתחדשות כבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
חמור, אבל לא קל, אבלציה hepatocyte מעוררת התחדשות כבד מונע מרה. לכן, לאחר טיפול Mtz וכישלון, חשוב לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz, אשר ניתן להעריך על ידי הקרינה CFP מהותית מfabp10a: transgene CFP-NTR. מאז אחוז קטן של הזחלים שטופלו Mtz יציג הלא ablated (0-5%) או באופן חלקי ablated כבדים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
Materials
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte ‘buds’ in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. 발생학. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
