पित्त चालित जिगर पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए zebrafish में Hepatocyte-विशिष्ट एबलेशन
Summary
To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Abstract
जिगर को पुनर्जीवित करने के लिए एक महान क्षमता है। Hepatocyte- या पित्त चालित जिगर उत्थान: hepatocytes, जिगर की कोशिकाओं parenchymal, दो तरीकों में से एक में पुनर्जीवित कर सकते हैं। पित्त संचालित उत्थान में, regenerating hepatocytes पित्त उपकला कोशिकाओं (BECs) से प्राप्त कर रहे हैं, जबकि hepatocyte चालित जिगर उत्थान में, regenerating hepatocytes, preexisting hepatocytes से निकाली गई है। Hepatocyte चालित जिगर के उत्थान के लिए भी महत्वपूर्ण है, जिगर उत्थान के वर्तमान को समझने के लिए योगदान दिया है कि उत्कृष्ट कृंतक मॉडल हैं। हालांकि, ऐसी कोई कृंतक मॉडल पित्त चालित जिगर के उत्थान के लिए मौजूद है। हमने हाल ही में BECs बड़े पैमाने पर गंभीर hepatocyte नुकसान पर hepatocytes को जन्म दे, जिसमें एक zebrafish जिगर चोट मॉडल को सूचना दी। इस मॉडल में, hepatocytes विशेष रूप से एक फार्माकोजेनेटिक साधन के द्वारा ablated कर रहे हैं। यहाँ हम hepatocytes काटकर अलग करने के लिए और बीईसी चालित जिगर पुनर्जनन प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए विस्तार से तरीकों को प्रस्तुत करते हैं।इस hepatocyte-विशिष्ट पृथक मॉडल आगे पित्त चालित जिगर उत्थान के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इन तरीकों को बढ़ाने या जिगर पुनर्जनन को दबाने कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए रासायनिक स्क्रीन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
जिगर एक बेहद पुनर्योजी अंग है। जिगर उत्थान के दौरान, hepatocytes regenerating, जिगर की कोशिकाओं parenchymal, पूर्व मौजूदा hepatocytes (hepatocyte चालित जिगर उत्थान) या BECs (पित्त चालित जिगर उत्थान) 1,2 से निकाली गई है। जिगर चोट आम तौर पर पहले से मौजूद hepatocytes के प्रसार elicits; hepatocyte प्रसार समझौता किया है हालांकि, जब BECs 2-4 hepatocytes के लिए योगदान कर सकते हैं। जिगर उत्थान के इन दो मोड चिकित्सकीय महत्वपूर्ण हैं। (क्योंकि जिगर ट्यूमर या जी जिगर दाताओं के जैसे,) मानव जिगर के एक हिस्से के सर्जिकल हटाने पर, शेष जिगर में hepatocytes खो जिगर बड़े पैमाने पर ठीक करने के लिए पैदा करना। BECs या जिगर पूर्वज कोशिकाओं (LPCs) regenerating hepatocytes 5,6 करने के लिए योगदान करने के लिए दिखाई देते हैं, इसलिए है कि इसके विपरीत, गंभीर जिगर की बीमारियों के साथ रोगियों में, hepatocyte प्रसार बहुत समझौता किया है। कृंतक 2/3 आंशिक hepatectomy मॉडल, जिसमेंhepatocytes खो जिगर बड़े पैमाने पर ठीक करने के लिए पैदा करना, काफी hepatocyte चालित जिगर उत्थान 7,8 की वर्तमान समझ के लिए योगदान दिया है। हालांकि, regenerating hepatocytes मुख्य रूप से BECs से निकाली गई है, जिसमें कोई वैध कृंतक मॉडल है। कई कृंतक जिगर विष मॉडल पित्त चालित जिगर उत्थान 2-4 की पहचान करने के लिए नेतृत्व हालांकि, चूहों में हाल ही वंश अनुरेखण पढ़ाई इन मॉडलों 9,10 में hepatocytes regenerating के लिए BECs की एक न्यूनतम अंशदान संकेत मिलता है। आंशिक hepatectomy 11-13 और एसिटामिनोफेन प्रेरित जिगर की क्षति 14,15 सहित कृंतक जिगर चोट मॉडलों में से कुछ, zebrafish करने के लिए आवेदन किया है और जिगर उत्थान में फंसा उपन्यास जीन या रास्ते की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया गया है। हालांकि, hepatocyte संचालित है, लेकिन बीईसी संचालित नहीं, जिगर उत्थान इन zebrafish जिगर चोट मॉडल में होता है। इसलिए, एक उपन्यास जिगर चोट मॉडल जिसमें BECs बड़े पैमाने पर regenerat के लिए योगदानhepatocytes आईएनजी बीईसी चालित जिगर उत्थान का एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है।
hepatocyte पृथक मॉडल के समग्र लक्ष्यों (1) BECs बड़े पैमाने पर regenerating hepatocytes में योगदान है, और (2) बीईसी चालित जिगर उत्थान अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र को स्पष्ट जिसमें एक जिगर चोट मॉडल उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं यहाँ का वर्णन किया। हम चोट की गंभीरता जिगर उत्थान की विधा को निर्धारित करता है कि धारणा है; इस प्रकार, हम पित्त चालित जिगर उत्थान गंभीर hepatocyte चोट पर आरंभ होता है कि भविष्यवाणी की। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करके एक zebrafish जिगर चोट मॉडल विकसित की है, टीजी (fabp10a: सीएफपी-एनटीआर) s931, कि अत्यधिक hepatocyte-विशिष्ट fabp10a तहत सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) के साथ जुड़े हुए बैक्टीरियल Nitroreductase (एनटीआर) को व्यक्त करता है प्रमोटर। एनटीआर एक साइटोटोक्सिक दवा में गैर विषैले प्रोड्रग, metronidazole (खेला), धर्मान्तरित के बाद से, यह केवल इरादा ablates NTR-इस मामले में, कोशिकाओं 16-18 व्यक्त hepatocytes। खेला इलाज की अवधि से छेड़छाड़, hepatocyte पृथक की हद तक नियंत्रित किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग करना, हम हाल ही में गंभीर hepatocyte हानि होने पर, BECs बड़े पैमाने पर आगे दो अन्य स्वतंत्र अध्ययन 20,21 द्वारा पुष्टि की गई है, जो regenerating hepatocytes 19 को जन्म दे कि सूचना दी। इसलिए, इस aforementioned कृंतक और zebrafish जिगर चोट मॉडल की तुलना में, हमारे hepatocyte पृथक मॉडल बीईसी चालित जिगर उत्थान के अध्ययन के लिए अधिक फायदेमंद है।
इस प्रोटोकॉल के लिए zebrafish hepatocyte पृथक मॉडल का उपयोग कर जिगर उत्थान प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस मॉडल पित्त चालित जिगर उत्थान अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण करने के लिए और रासायनिक स्क्रीन को दबाने या जिगर उत्थान बढ़ाने कर सकते हैं कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
गंभीर, लेकिन हल्के नहीं, hepatocyte पृथक पित्त चालित जिगर उत्थान elicits। सीएफपी-एनटीआर transgene: इसलिए, खेला उपचार और वार्शआउट के बाद, यह fabp10a से आंतरिक CFP प्रतिदीप्ति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो खेला इलाज …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
Materials
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
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