Hepatocytter spesifikke Ablation i Sebrafisk å studere Galledrevet Liver Regeneration

Summary

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Abstract

Leveren har en stor evne til å regenerere. Hepatocytter, parenchymal cellene i leveren, kan regenerere på en av to måter: hepatocyte- eller galledrevet leveren regenerering. I hepatocytter drevet leveren regenerasjon, er regenererende hepatocytter avledet fra preexisting hepatocytter, mens i galle-drevet regenerering, er regenererende hepatocytter avledet fra galle epitelceller (becs). For hepatocytter-drevet leveren regenerasjon, det er gode gnagermodeller som har vesentlig bidratt til dagens forståelse av leveren regenerering. Men det finnes ingen slik gnager modell for galledrevet leveren regenerering. Vi har nylig rapportert om en sebrafisk leverskade modell der becs omfattende gi opphav til hepatocytter ved alvorlig hepatocytter tap. I denne modellen er hepatocytter spesielt ablated av noen farmakogenetiske midler. Her presenterer vi i detalj de metoder for å ablate hepatocytter og å analysere BEC-drevet leveren regenereringsprosess.Dette hepatocytter spesifikke ablasjon modellen kan videre brukes til å oppdage de underliggende molekylære og cellulære mekanismer for galledrevet leveren regenerering. Videre kan disse metodene brukes til kjemiske skjermer for å identifisere små molekyler som utvider eller undertrykke leveren regenerering.

Introduction

Leveren er en svært regenerativ organ. I leveren regenerering regenerering hepatocytter, parenchymal cellene i leveren, er avledet fra pre-eksisterende hepatocytter (hepatocytter-lever drevet restitusjon) eller becs (galledrevet leveren restitusjon) ^1,2. Leverskade utløser vanligvis spredning av pre-eksisterende hepatocytter; men når hepatocytter spredning er kompromittert, kan becs bidra til leverceller ^2-4. Disse to moduser av leveren regenerering er klinisk signifikant. Etter kirurgisk fjerning av en del av det humane leveren (f.eks, på grunn av levertumorer eller levende lever donorer), hepatocytter i den gjenværende lever proliferere for å gjenvinne den tapte levermassen. I motsetning til pasienter med alvorlige leversykdommer, hepatocytter spredning er sterkt svekket, slik at becs eller lever stamceller (LPC) synes å bidra til å gjenoppfriske hepatocytter ^5,6. Den gnager 2/3 delvis hepatectomy modellen, derhepatocytter sprer å gjenopprette den tapte levermasse, vesentlig har bidratt til dagens forståelse av hepatocytter drevet leveren regenerering ^7,8. Men det er ingen gyldig gnager modell der regenererende hepatocytter er i hovedsak hentet fra becs. Selv om flere gnager lever toksin modeller ført til identifisering av galledrevet leveren regenerering ^2-4, siste avstamning sporing studier på mus viser en minimal bidrag becs å regenerere hepatocytter i disse modellene ^9,10. Noen av de gnager leverskade modeller, inkludert delvis hepatectomy ^11-13 og paracetamol-indusert leverskade ^14,15, har blitt brukt til sebrafisk og førte til identifisering av nye gener eller veier innblandet i leveren regenerering. Imidlertid hepatocytter-drevet, men ikke BEC-drevet, oppstår leveren regenerering i disse sebrafisk leverskade modeller. Derfor er en ny leverskade modell hvor becs utstrekning bidrar til regenerating hepatocytter er nødvendig for en bedre forståelse av BEC-drevet leveren regenerering.

De overordnede målene for hepatocytter ablasjon modellen beskrevet her er (1) å generere en leverskade modell der becs omfattende bidra til regenererende hepatocytter, og (2) belyse de molekylære og cellulære mekanismene bak BEC-drevet leveren regenerering. Vi antok at alvorlighetsgraden av skaden bestemmer modusen for leveren regenerasjon; dermed spådd vi at galledrevet leveren regenerering ville starte på alvorlig hepatocytter skade. For å teste denne hypotesen, har vi utviklet en sebrafisk leverskade modellen ved å generere en transgen linje, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^s931, som sterkt uttrykker bakterie Nitroreductase (NTR) smeltet sammen med cyan fluorescerende protein (CFP) under hepatocytter spesifikke fabp10a promoter. Siden NTR konverterer giftfri prodrug, metronidazol (Mtz), inn i en cellegift, ablates det bare den tiltenkte NTR-uttrykkende celler ^16-18, i dette tilfellet, hepatocyttene. Ved å manipulere varigheten av Mtz behandling, kan omfanget av hepatocytter ablasjon kontrolleres. Ved å bruke denne modellen, vi nylig rapportert at ved alvorlig tap av hepatocytter, Wien omfattende gi opphav til regenererende hepatocytter ^19, som ble ytterligere bekreftet ved to andre uavhengige undersøkelser ^20,21. Derfor, i forhold til den tidligere nevnte gnagere og sebrafisk leverskade modell, er vår hepatocytter ablasjon modell mer fordelaktig for å studere BEC-drevet leveren regenerering.

Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å utføre leveren restitusjon eksperimenter ved hjelp av sebrafisk hepatocytter ablasjon modell. Denne modellen vil være hensiktsmessig for å bestemme mekanismene bak galledrevet leveren regenerering og for kjemiske skjermer for å identifisere små molekyler som kan undertrykke eller forsterke leveren regenerering.

Protocol

Sebrafisk ble hevet og oppvokst i henhold til standard prosedyre; Forsøkene ble godkjent av University of Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Utarbeidelse av embryoer / larver For å gjennomføre tidsbestemt parringer, satt opp voksen hann og hunn Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 hemizygous eller homozygot fisker O / N og plassere en skillelinje mellom dem. Fjern denne skillelinjen følgende morgen når parring er ønsket. Samle embryoer ved å …

Representative Results

MTZ behandling for 36 timer (A36h, A står for ablasjon) 3,5 til 5 dpf dramatisk redusert leverstørrelse (figur 1B). Etter Mtz utvasking, regnes som begynnelsen på leveren regenerering (R), sterk fabp10a: CFP-NTR og fabp10a: DsRed uttrykk dukket opp igjen i løpet av 30 timer (figur 1B). Den intrahepatisk gallenettverket, som målt ved ekspresjon av Alcam som er tilstede i membranen til Wien 22, først kollapset men ble reetablert ved 54 timer etter utvask…

Discussion

Alvorlig, men ikke mild, utløser hepatocytter ablasjon galledrevet leveren regenerering. Derfor, etter Mtz behandling og utvasking, er det viktig å undersøke leverstørrelse på Mtz-behandlede larver, som kan vurderes ved indre CFP fluorescens fra fabp10a: CFP-NTR transgenet. Siden en liten prosentandel av Mtz-behandlede larver viser ikke-ablated (0-5%), eller delvis ablateres (10-20%) lever, er det viktig å sortere ut og bare analysere larver med en meget liten leveren, noe er et tegn på alvorlig hepatocy…

Materials

3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Mounting media (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
clear nail polish	Fisher Scientific	50949071
fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
glass slide	Fisher Scientific	12-544-1
glass coverslip	Fisher Scientific	12-540-A and 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (mouse anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 dilution
goat anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 dilution
rat anti-RFP	Allele Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	1:500 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 dilution
Cy3 donkey anti-rat IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 dilution
dissecting microscope	Leica Microsystems	S6F
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA
confocal microscope	Carl Zeiss	LSM700
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
10X PBS			25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.  Bring to 1 L with distilled water.  Adjust pH 7.  Autoclave for 20 min at 121°C.
1X PBSDT			0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.
PEM buffer			30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Bring to 1 L with distilled water.  Adjust pH 7.
Blocking solution			Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.