To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Levern har en stor förmåga att regenerera. Hepatocyter, de parenkymala cellerna i levern, kan regenerera på ett av två sätt: hepatocyte- eller biliär driven leverregenerering. I hepatocyte driven leverregenerering, är regenererande leverceller som härrör från redan existerande leverceller, medan i galla driven förnyelse är regenererande leverceller som härrör från gall-epitelceller (BEC). För hepatocyte driven leverregenerering, det finns utmärkta gnagarmodeller som väsentligt har bidragit till den nuvarande förståelse av leverregenerering. Det finns dock ingen sådan gnagarmodell för galla driven leverregenerering. Vi har nyligen rapporterat om en zebrafisk leverskada modell där BEC ger omfattande upphov till leverceller vid svår hepatocyte förlust. I denna modell är hepatocyter specifikt ablation av ett farmakogenetiska medel. Här presenterar vi i detalj metoderna för att avlägsna hepatocyter och att analysera BEC driven leverregenereringsprocessen.Detta hepatocyt-specifika ablation modell kan vidare användas för att upptäcka de bakomliggande molekylära och cellulära mekanismer av gallan driven leverregenerering. Dessutom kan dessa metoder tillämpas på kemiska skärmar för att identifiera små molekyler som förstärker eller undertrycker leverregenerering.
Levern är ett mycket regenerativ orgel. Under leverregenerering, regenererande leverceller, de parenkymceller i levern, härrör från redan existerande leverceller (hepatocyte driven leverregenerering) eller BEC (gallan driven leverregenerering) 1,2. Leverskada framkallar oftast spridningen av redan existerande leverceller; men när hepatocytproliferation äventyras, kan BEC bidra till hepatocyter 2-4. Dessa två typer av leverregenerering är kliniskt signifikant. Efter kirurgiskt avlägsnande av en del av den humana levern (t.ex. på grund av levertumörer eller levande leverdonatorer), hepatocyter i den återstående levern prolifererar för att återvinna förlorad levermassan. Däremot hos patienter med svåra leversjukdomar, hepatocytproliferation kraftigt äventyras, så att BEC eller lever progenitorceller (LPCs) verkar bidra till regenere hepatocyter 5,6. Den gnagare 2/3 partiell hepatektomi modell, därhepatocyter föröka att återvinna förlorad levermassan, har väsentligt bidragit till den nuvarande förståelse av hepatocyte driven leverregenerering 7,8. Det finns dock ingen giltig gnagarmodell där regenere hepatocyter huvudsakligen härrör från BEC. Trots att flera gnagare levertoxin modeller lett till identifiering av galla driven leverregenerering 2-4, senaste härstamning spåra studier på möss tyder på en minimal bidrag BEC att regenerera leverceller i dessa modeller 9,10. Några av gnagare leverskada modeller, inklusive partiell hepatektomi 11-13 och paracetamol-inducerad leverskada 14,15, har tillämpats på zebrafisk och ledde till identifiering av nya gener eller vägar inblandade i leverregenerering. Men hepatocyte driven, men inte BEC-driven, sker leverregenerering i dessa zebrafisk leverskada modeller. Därför är en ny leverskada modell där BEC utsträckning bidra till regeneratDet behövs ing hepatocyter för en bättre förståelse av BEC driven leverregenerering.
De övergripande målen för hepatocyte ablation modell som beskrivs här är (1) för att generera en leverskada modell där BEC utsträckning bidra till regenere hepatocyter, och (2) klargöra de molekylära och cellulära mekanismer som ligger bakom BEC driven leverregenerering. Vi antog att skadornas bestämmer läget för leverregenerering; alltså, förutspådde vi att gallan driven leverregenerering skulle initiera vid svår hepatocyte skador. För att testa denna hypotes, vi utvecklat en zebrafisk leverskada modell genom att generera en transgen linje, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, som är mycket uttrycker bakterie nitroreduktas (NTR) smält med cyan fluorescerande protein (GFP) under hepatocyt specifika fabp10a promotor. Sedan NTR omvandlar giftfri prodrug, metronidazol (Mtz), till ett cytotoxiskt läkemedel, ablates det endast den avsedda NTR-uttryckande celler 16-18, i det här fallet, de hepatocyter. Genom att manipulera varaktighet Mtz behandling, kan styras omfattningen av hepatocyte ablation. Med hjälp av denna modell, nyligen rapporterade vi att vid allvarliga hepatocyte förlust, BEC ge omfattande upphov till regenererande leverceller 19, vilket ytterligare bekräftades av två andra oberoende studier 20,21. Därför, jämfört med den tidigare nämnda gnagare och zebrafisk leverskademodeller, är vår hepatocyt ablation modell mer fördelaktig för att studera BEC driven leverregenerering.
Detta protokoll beskriver en metod för genomförande leverregenereringsexperiment med hjälp av zebrafisk hepatocyt ablation modell. Denna modell kommer att vara lämpligt för att bestämma mekanismerna bakom gallan driven leverregenerering och för kemiska skärmar för att identifiera små molekyler som kan undertrycka eller utökar leverregenerering.
Svår, men inte mild, framkallar hepatocyte ablation gallan driven leverregenerering. Därför, efter Mtz behandling och wash-out, är det viktigt att undersöka levern storlek Mtz-behandlade larver, som kan bedömas genom inneboende GFP fluorescens från fabp10a: GFP-NTR transgen. Eftersom en liten procentandel av Mtz-behandlade larver kommer att visa icke-ablationsbehandlad (0-5%) eller partiellt avlägsnade (10-20%) av lever, är det viktigt att reda ut och endast analysera larverna med en mycket liten lever…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |