עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית
Summary
Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
Abstract
הערכה היסטולוגית של ביופסיות שריר שימשה ככלי הכרחי בהבנה של ההתפתחות וההתקדמות של הפתולוגיה של הפרעות עצבית-שרירית. עם זאת, על מנת לעשות זאת, טיפול נכון צריך לקחת כאשר מוציא ושימור רקמות להשיג צביעה אופטימלית. אחת שיטות לשימור רקמות כרוכה תיקון רקמות בפורמלין ולאחר מכן הטבעתם בשעוות פרפין. שיטה זו שומרת מורפולוגיה היטב ומאפשרת לאחסון לטווח ארוך ב RT, אבל הוא מסורבל ודורשת טיפול בכימיקלים רעילים. יתר על כן, תוצאות קיבעון פורמלדהיד בקישור צולב אנטיגן, אשר מחייב פרוטוקולים אחזור אנטיגן לimmunostaining היעיל. להיפך, חתך קפוא אינו דורש קיבוע ובכך שומר על קונפורמציה אנטיגן ביולוגית. שיטה זו גם מספקת יתרון בולט בסיבוב מהיר סביב זמן, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד במצבי צורך הערכה היסטולוגית מהירה כמו intraoperative ביופסיות כירורגיות. כאן אנו מתארים את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר להדמיה עם כתמים היסטולוגית וחיסוניים שונים.
Introduction
בדיקה של היסטולוגיה השריר משחקת תפקיד קריטי בהבנת סוגים שונים של הפרעות עצבית-שרירית של 1-4. בשילוב עם טכניקות אחרות, זה מאפשר לחוקרים לקבל מושג טוב יותר של הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה וגם יכולים להיות חיוני כדי להעריך את היעילות של התערבות טיפולית 5-10. עם זאת, כדי להיות מדויק, הרקמות צריכה להישמר בצורה הנכונה על מנת לשמר את המצב הפיזיולוגי מייד לפני הכריתה. זה דורש זהירות רבה במהלך ההסרה, שימור, חתך, וצביעה.
ניתן להכין רקמות בשתי דרכים שונות למחקר מיקרוסקופי אור. השיטה, פרפין פורמלין הקבוע הראשון משובץ קטעים (FFPE), דורש רקמות להיות קבועים בפורמלין שנאגרו טבעי 10% לפני שמוטבעים בשעוות פרפין 11,12. צעד הקיבעון עוזר לשמר מורפולוגיה טובה יותר, אבל יחסי ציבור אנדוגני קישורים גם צולביםoteins לפיכך מחייב נהלים אחזור אנטיגן המורכב עבור immunostaining ומבטל את האפשרות של מכתים האנזימטית בסעיפים כגון 12. חלקים קפואים, לעומת זאת, לא צריכים להיות מראש קבועים או מעובד; לכן, חלבונים יכולים לשמור תצורות ביולוגיות יליד 13,14. יתר על כן, חלקים קפואים גם לאפשר לזמן אספקה מהיר, שלעתים יש צורך, למשל באבחון תוך הניתוחי של סרקומות וביופסיות כירורגיות אחרות 15. עם זאת, אם לא נעשה כראוי, בשיטה זו היא נוטה להקפיא נזק, אשר מציג שינויים בארכיטקטורת שרירים מה שהופכים את החלקים שאינם ראויים לבדיקה היסטולוגית. מאמר זה מתאר את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר על מנת להשיג צביעה אופטימלית לבדיקה נאותה.
Protocol
Representative Results
Discussion
היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה שימשו ככלים מרכזיים בהבנת הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה בהפרעות עצבית-שרירית שונות. קלסי, ביופסיות שריר היו קבועות ראשונה בפורמלין ולאחר מכן משובצות בשעוות פרפין. בעוד קיבעון פורמלדהיד שומר ארכיטקטורת רקמה ומאפשר אחסון והובלת רקמה ב RT,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Materials
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as ‘gold standard’ for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
