Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica

Summary

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Abstract

A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.

Introduction

O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares ^1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica ^5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração.

Os tecidos podem ser preparados de duas maneiras diferentes para estudo microscópico luz. O método primeiro, fixados em formalina embebidos em parafina (FFPE) seções, requer tecidos fixados em formol 10% tamponado naturais antes de ser incorporado com cera de parafina ^11,12. A etapa de fixação ajuda a preservar a morfologia melhor, mas também ligações cruzadas pr endógenooteins necessitando, portanto, de antigénios intrincado procedimentos de recuperação para a imunocoloração e eliminando a possibilidade de coloração enzimática em tais seções ^12. As secções congeladas, por outro lado, não precisa de ser pré-fixo ou processado; por conseguinte, as proteínas são capazes de reter conformações nativas biológicos ^13,14. Além disso, cortes congelados também permitem rápido tempo de resposta, que às vezes é necessário, por exemplo, no diagnóstico intra-operatório de sarcomas e outras biópsias cirúrgicas ^15. No entanto, se não for feito corretamente, este método é propenso a congelar danos, que introduz alterações à arquitetura muscular fazendo as seções impróprios para exame histológico. Este artigo irá delinear o método mais eficaz para preparar biópsias musculares, a fim de alcançar uma óptima coloração para exame adequado.

Protocol

1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano. Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical. Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência …

Representative Results

A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados ​​deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de …

Discussion

A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a…

Materials

Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029
OCT	4583	Sakura Inc.	Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific