Ferric-Chloride geïnduceerde trombose Muis Model op halsslagader en Mesenterium Vessel

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

Het onderzoek van de bij de ontwikkeling van trombose en de evaluatie van de effectiviteit van anti-trombotische geneesmiddelen mechanismen vereist gevestigde experimentele diermodellen. Grote diermodellen waren de eersten die worden gebruikt als zij grote schepen meer op mensen dan knaagdieren ^1. Echter, hoge kosten, de grotere vereiste voorzieningen en de moeilijkheid genetisch manipuleren zijn belangrijke nadelen aan het gebruik en grote dieren zijn thans beperkt tot late preklinische studies eenmaal voorproeven op knaagdieren eindresultaten ² gegeven. Met brede beschikbaarheid van transgene en knockout stammen en hun kleine grootte die de hoeveelheid antitrombotische geneesmiddelen nodig voor in vivo onderzoek minimaliseert worden muizen voornamelijk gebruikt voor trombose onderzoek. Daarom zijn verscheidene modellen van trombotische aandoeningen ontwikkeld bij muizen ^3.

Vele gevestigde trombose modellen verstoren de intimeen laag van de vaatwand, gevolgd door blootstelling van de sub endotheliale extracellulaire matrix om de bloedstroom induceren van de vorming van bloedstolsels ^4. De trombi kan van blootstelling van collageen waarvan bloedplaatjes activering triggers of / en de blootstelling van weefselfactor waarvan de stollingscascade ⁵ activeert. Verschillende technieken worden vervolgens gebruikt om de oorspronkelijke vaatschade bereiken. Pierangeli et al. Ontwikkelden een mechanische verstoring model met een microchirurgie tool op de dijader ^6. Kikushi et al. Beschreef een model dat bestaat uit de toediening van een foto reactieve verbinding (Rose Bengal) dat zich ophoopt in de lipide bilaag van endotheliale cellen gevolgd door de specifieke excitatie van de vaatwand plaats met groen licht (540 nm) ^7. De schade kan ook veroorzaakt worden door een korte hoge intensiteit pulse laser belichting ^8. Een andere techniek allereerst vastgesteld aan de halsslagader van rattenbestaat in de topicale toepassing van ferrichloride _(FeCl3) ^9. In dit geval, het vaartuig erosie resultaten uit die door _FeCl3 vrije radicalen die lipideperoxidatie en vernietiging van endotheelcellen ¹⁰ veroorzaakt. De schade induceert de expressie van verschillende adhesiemoleculen triggering bloedplaatjesadhesie en aggregatie en leukocyten rekrutering. Het is aangetoond dat leucocyten, met name neutrofielen, spelen een cruciale rol bij de activatie van de bloedcoagulatie cascade die leidt tot trombose ^11. Deze methode is bijzonder geschikt voor de stollingscascade te reproduceren; onderzoekers moeten in gedachten houden dat, in dit muismodel, trombose wordt meestal veroorzaakt bij gezonde vaten terwijl trombose bij mensen voornamelijk plaatsvindt in zieke bv houden. atherosclerotische vaten.

Aangezien dit model is zeer eenvoudig te implementeren en is ook effectief bij muizen, is nu de meest gebruikte trombose model voor kleine dieren in vivo studies. Bovendien biedt deze techniek de mogelijkheid om de vorming van trombi in diverse vaten veroorzaken. Target schepen kunnen slagaders of aders van grote diameter (carotis, dijbeen, vena cava) of kleine diameter (mesenterium, cremaster) ^12-14. Meer recent werd ook gebruikt op het proximale cerebralis media een model van beroerte ¹⁵ ontwikkelen. De trombose formatie kan direct worden waargenomen door het opklaren na fluorescerende etikettering van bloedplaatjes en leukocyten of gevolgd door het meten van de bloedstroom daling met een temperatuur sonde of een Doppler sonde ^12,16,17. Diverse parameters zoals de occlusietijd, trombusvorming tijd of trombus grootte kan vervolgens worden onderzocht. De fysiologische verschillen tussen de vaten onderzochte resulteren in aanzienlijke verschillen in de trombi verkregen. Daarom onderzoekers selecteert gewoonlijk het doelvat volgens de parameters die ze willen measure en / of de ziekte instelling die ze willen onderzoeken. Kenmerkend het model de halsslagader relevanter voor onderzoek naar atherotrombose betrekking tot myocardinfarct of beroerte, terwijl studies naar de vena cava relevanter voor onderzoek naar diepe veneuze trombose. De toegankelijkheid van de verschillende vaten bepaalt ook de methode voor groei trombus te meten. Bijvoorbeeld, de mesenteriale vaten eenvoudig kunnen worden geopend waardoor dit model geschikt voor intravitale microscopische observatie en het bestuderen van de dynamica van trombusvorming. De halsslagader is minder toegankelijk, maar groter waardoor de bloedstroom metingen en bieden een uitstekend model om occlusieve trombose te bestuderen.

Het ferrichloride geïnduceerde trombose model heeft enorme vooruitgang die in het begrijpen van deze pathologie. Het is gebruikt in veel studies gericht op de rol van de von Willebrand factor in trombosevorming ^18,19. Gecombineerd met genetische modicatie technieken heeft het mogelijk gemaakt een groot aantal specifieke gen betrokken bij trombotische aandoeningen. Lamrani et al. bijvoorbeeld gebleken dat een knock-in van het JAK2 ^V617F gen is gekoppeld aan een versnellende vorming van instabiele stolsel ^20. Zhang et al. Hebben de fysiologische gevolgen van de bloedplaatjes P2Y12 receptor onderzocht en aangetoond dat transgene muizen overexpressie specifiek deze receptor in bloedplaatjes alleen weergegeven een snelle en stabiele trombusvorming in mesenterica verwond met _FeCl3 ^21. De cruciale rol van weefsel-type plasminogeen activator (tPA) en urokinase-type plasminogeen activator (uPA) in fibrine degradatie leidt is onderzocht bij deze methode ^22. Verder biedt dit model ook een eenvoudige en nauwkeurige manier testen van de fibrinolytische capaciteit van vele nieuwe geneesmiddelen in vivo. Zo hebben Wang et al. Dit model th tweedehandse preklinische validatie van een nieuw recombinant plasminogeenactivator gericht tegen geactiveerde plaatjes ^23. Deze methode staat ook de validatie van therapeutische eiwitten geïsoleerd uit het speeksel van teken, vampier vleermuizen en muggen of uit het gif van slangen met een specifieke identificatie van de doelgroep ^24-27. Deze voorbeelden demonstreren de veelzijdigheid van het ferrichloride model. In dit artikel richten we ons op twee methoden en studie ijzerchloride geïnduceerde trombose op twee verschillende type drukvat; mesenterische vat en halsslagader.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Alfred Medical Research en Opleiding Precinct Animal Ethics Committee (E / 1534/2015 / B). Alle chirurgische manipulaties werden uitgevoerd onder volledige narcose en de dieren hebben geen pijn ervaren in elk stadium. Alle experimenten worden beschreven, zijn niet-herstel. 1. Voorbereiding Snijd dunne banden van filter papier (1 mm x 2 mm). Vers bereiden 2 oplossingen ferrichloride van 4% (w / v) en 6% (w / v) verdu…

Representative Results

De fluorescentie microscopie intravitale observatie van het mesenterium wordt de accumulatie van Rhodamine 6G tonen gelabelde bloedplaatjes en leukocyten langs de vatwand verwond door FeCl3. De geleidelijke vorming van een gedeeltelijk thrombus wordt bewaakt in een 200 urn mesenterium vat (Figuur 1). Een trombus langzaam weergegeven en is duidelijk herkenbaar na de eerste minuut van blootstelling aan FeCl3 (figuur 1, t = 60 sec). 40 sec na verwijdering van het filt…

Discussion

De ijzerchloride geïnduceerde trombose model is een uitstekend research tool. Zoals getoond in deze studie, is het uiterst eenvoudig te implementeren en bij gebruik in combinatie met intravitale microscopie of Doppler flowmeter, biedt een goede real-time monitoring van trombusvorming. De belichtingstijd en de concentratie van _FeCl3 aanpassen, maar biedt ook de mogelijkheid om hetzij niet-occlusief of occlusieve trombi produceren.

Deze werkwijze heeft ook een aantal beperkingen. I…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60