Хлорного железа, вызванной Тромбоз мышь Модель на сонной артерии и брыжейки судна
Summary
The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.
Abstract
Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.
Introduction
Изучение механизмов, участвующих в развитии тромбоза и оценки эффективности антитромботических лекарств требует хорошо известны экспериментальные животные модели. Большие модели на животных были первыми, чтобы быть использованы, поскольку они обеспечивают большие сосуды больше похож на человека, чем грызунов 1. Тем не менее, высокая стоимость, большие объекты, необходимые и трудность в манипулировании их генетически являются основными недостатками в их использовании и крупные животные в настоящее время ограничивается конце доклинических исследований сразу предварительные испытания на грызунах дали убедительных результатов 2. С широкой доступности трансгенных и нокаут штаммов и их небольшого размера, что минимизирует количество антитромбоцитарных препаратов, необходимых для тестирования в естественных условиях, мыши используются в основном для тромбоза исследований. Таким образом, несколько моделей тромботических заболеваний были разработаны в мышей 3.
Многие установленные модели тромбоза нарушить интимслой стенки сосуда, с последующим воздействием на суб эндотелиальной внеклеточного матрикса в кровоток индуцировать образование тромбов 4. Тромбы могут возникнуть в результате воздействия коллагена, который вызывает активацию тромбоцитов и / или от воздействия тканевого фактора, который активирует каскад коагуляции 5. Некоторые методы которые затем используют для достижения первоначальной травмы сосудов. Pierangeli др. Разработали механическую модель с разрывом микрохирургии инструмента на бедренную вену 6. Kikushi др. Описал модель, которая состоит в управлении фотографией реактивной соединения (бенгалроза), который накапливается в липидный бислой эндотелиальных клеток с последующим конкретной возбуждения стенки сосуда интересов с зеленым светом (540 нм) 7. Травма может также быть вызвано короткого высокоинтенсивного импульса лазерного излучения 8. Другой метод, во-первых создана на сонной артерии крыссостоит в местном применении хлорида железа (FeCl 3) 9. В этом случае результаты судно денудационные от свободных радикалов, генерируемых FeCl 3, который вызывает перекисное окисление липидов и разрушение эндотелиальных клеток 10. Травма индуцирует экспрессию нескольких молекул адгезии, вызывающих адгезию тромбоцитов и агрегацию, а также лейкоцитов набора. Было показано, что лейкоциты, в частности, нейтрофилы, играют решающую роль в активации каскада свертывания крови, ведущего к тромбозу 11. Этот метод хорошо подходит для воспроизведения каскад коагуляции; Следователи должны иметь в виду, что в этой модели мыши, тромбоз обычно возникает у здоровых сосудов, тогда как тромбоз у человека в основном происходит в больном например. атеросклеротические сосуды.
В этой модели очень прост в реализации и также эффективен у мышей, то теперь в основном используется режим тромбозл для маленького животного в естественных условиях исследования. Кроме того, этот метод дает возможность индуцировать образование тромбов в различных сосудах. Целевые суда могут быть артерий или вен большого диаметра (сонной, бедренной, кава) или малого диаметра (брыжейки, кремастер) 12-14. Совсем недавно, он был также использован на проксимальной средней мозговой артерии разработать модель инсульта 15. Формирование тромбоза может быть непосредственно наблюдается прижизненной микроскопии после флуоресцентного мечения тромбоцитов и лейкоцитов или контролируется путем измерения уменьшение кровотока с датчиком температуры или доплеровского зонда 12,16,17. Некоторые параметры, такие как время окклюзии, время образования тромба или размера тромба может быть исследована. Физиологические различия между судами исследованы привести к значительным изменениям в тромбов, полученного. Таким образом, исследователи, как правило, выбор целевого сосуда в соответствии с параметрами, которые они хотят measuвновь и / или болезнь установки они хотят, чтобы исследовать. Как правило, модели на сонной артерии является более актуальным для исследования атеротромбоза, связанного с инфарктом миокарда или инсульта в то время как исследования по полой вены являются более актуальными для исследования глубокого венозного тромбоза. Доступность различных сосудов также определяет метод, используемый для измерения роста тромба. Например, мезентериальные сосуды легко получить доступ делает эта модель хорошо подходит для прижизненной микроскопом и исследования динамики формирования тромба. Сонной артерии менее доступен, но больше, позволяющие измерения кровотока и обеспечивают отличную модель для изучения окклюзионной тромбоз.
Хлорид железа индуцированных тромбоза модель обеспечила огромный прогресс в понимании этой патологии. Он был использован во многих исследованиях, посвященных роли фактора Виллебранда в формировании тромбоза 18,19. В сочетании с генетической модусовметоды фикации, это позволило выявить многие специфического гена, участвующего в тромботических нарушений. Ламрани др. Например, показали, что стук в гена JAK2 V617F связано с ускоряющим образование неустойчивых сгустка 20. Чжан и др. Исследовали физиологические последствия рецептора тромбоцитов P2Y12 и показали, что трансгенные мыши, избыточно специально этот рецептор тромбоцитов только отображается более быстрое и стабильное образование тромбов в брыжеечной артерии травмированного с FeCl 3 21. Решающая роль тканевого типа активатор плазминогена (ТАП) и урокиназы типа активатора плазминогена (УАП) в процессе деградации фибрина также были исследованы в этом методе 22. Кроме того эта модель также обеспечивает простой и точный способ проверки фибринолитической потенциала многих новых препаратов в естественных условиях. Например, Ван и др. Использовали эту модель для гое доклинические проверка нового рекомбинантного активатора плазминогена, направленные против активированных тромбоцитов 23. Этот метод также включен проверку терапевтических белков, выделенных из слюнных клещей, летучих мышей-вампиров, и комаров или из яда змей с конкретной идентификации цели 24-27. Эти примеры показывают универсальность железа хлорида модели. В этой статье мы сосредоточимся на двух методов и изучения железа хлорида индуцированного тромбоза в двух различных типов судов; брыжеечных сосудов и сонная артерия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Железа хлорид индуцированных тромбоза модель отлично инструмент исследования. Как показано в этом исследовании, это очень легко реализовать, и при использовании в сочетании с прижизненной микроскопии или доплеровского расходомера, что обеспечивает хорошую мониторинг в реальном вре?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить техническую поддержку от Joy Яо и доктора Карен Alt, а также финансирование из NHMRC и НФЗ.
Materials
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40 % (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
- Leadley, R. J., Chi, L., Rebello, S. S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. J Pharmacol Toxicol Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Johnson, G. J., Griggs, T. R., Badimon, L. The utility of animal models in the preclinical study of interventions to prevent human coronary artery restenosis: analysis and recommendations. On behalf of the Subcommittee on Animal, Cellular and Molecular Models of Thrombosis and Haemostasis of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 81 (5), 835-843 (1999).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92 (3), 486-494 (2004).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100 (7), 979-991 (2007).
- Furie, B., Furie, B. C. Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med. 359 (9), 938-949 (2008).
- Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H., Anderson, G., Harris, E. N. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74 (5), 1361-1367 (1995).
- Kikuchi, S., Umemura, K., Kondo, K., Saniabadi, A. R., Nakashima, M. Photochemically induced endothelial injury in the mouse as a screening model for inhibitors of vascular intimal thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18 (7), 1069-1078 (1998).
- Rosen, E. D., Raymond, S., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158, 1613-1622 (2001).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60 (4), 269-280 (1990).
- Eckly, A., Hechler, B., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9 (4), 779-789 (2011).
- Darbousset, R., et al. Involvement of neutrophils in thrombus formation in living mice. Pathol Biol (Paris). 62 (1), 1-9 (2014).
- Denis, C., Methia, N., et al. A mouse model of severe von Willebrand disease: defects in hemostasis and thrombosis). Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (16), 9524-9529 (1998).
- Wang, X., Hagemeyer, C. E., et al. Novel single-chain antibody-targeted microbubbles for molecular ultrasound imaging of thrombosis: validation of a unique noninvasive method for rapid and sensitive detection of thrombi and monitoring of success or failure of thrombolysis in mice. Circulation. 125 (25), 3117-3126 (2012).
- Wang, X., Smith, P. L., Hsu, M. -. Y., Ogletree, M. L., Schumacher, W. A. Murine model of ferric chloride-induced vena cava thrombosis: evidence for effect of potato carboxypeptidase inhibitor. J Thromb Haemost. 4 (2), 403-410 (2006).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Jirousková, M., Chereshnev, I., Väänänen, H., Degen, J. L., Coller, B. S. Antibody blockade or mutation of the fibrinogen gamma-chain C-terminus is more effective in inhibiting murine arterial thrombus formation than complete absence of fibrinogen. Blood. 103 (6), 1995-2002 (2004).
- Dubois, C., Panicot-Dubois, L., Merrill-Skoloff, G., Furie, B., Furie, B. C. Glycoprotein VI-dependent and -independent pathways of thrombus formation in vivo. Blood. 107 (10), 3902-3906 (2006).
- Navarrete, A. -. M., Casari, C., et al. A murine model to characterize the antithrombotic effect of molecules targeting human von Willebrand factor. Blood. 120 (13), 2723-2732 (2012).
- Rayes, J., Hollestelle, M. J., et al. Mutation and ADAMTS13-dependent modulation of disease severity in a mouse model for von Willebrand disease type 2B. Blood. 115 (23), 4870-4877 (2010).
- Lamrani, L., Lacout, C., et al. Hemostatic disorders in a JAK2V617F-driven mouse model of myeloproliferative neoplasm. Blood. 124 (7), 1136-1145 (2014).
- Zhang, Y., Ye, J., et al. Increased platelet activation and thrombosis in transgenic mice expressing constitutively active P2Y12. J Thromb Haemost. 10 (10), 2149-2157 (2012).
- Schäfer, K., Konstantinides, S., et al. Different mechanisms of increased luminal stenosis after arterial injury in mice deficient for urokinase- or tissue-type plasminogen activator. Circulation. 106 (14), 1847-1852 (2002).
- Wang, X., Palasubramaniam, J., et al. Towards effective and safe thrombolysis and thromboprophylaxis: preclinical testing of a novel antibody-targeted recombinant plasminogen activator directed against activated platelets. Circ Res. 114 (7), 1083-1093 (2014).
- Decrem, Y., et al. Ir-CPI, a coagulation contact phase inhibitor from the tick Ixodes ricinus, inhibits thrombus formation without impairing hemostasis. J Exp Med. 206 (11), 2381-2395 (2009).
- Ma, D., et al. Desmolaris, a novel factor XIa anticoagulant from the salivary gland of the vampire bat (Desmodus rotundus) inhibits inflammation and thrombosis in vivo. Blood. 122 (25), 4094-4106 (2013).
- Lei, X., et al. Anfibatide, a novel GPIb complex antagonist, inhibits platelet adhesion and thrombus formation in vitro and in vivo in murine models of thrombosis. Thromb Haemost. 111 (2), 279-289 (2014).
- Waisberg, M., et al. Plasmodium falciparum infection induces expression of a mosquito salivary protein (Agaphelin) that targets neutrophil function and inhibits thrombosis without impairing hemostasis. PLoS Pathog. 10 (9), e1004338 (2014).
- Owens, A. P., Lu, Y., Whinna, H. C., Gachet, C., Fay, W. P., Mackman, N. Towards a standardization of the murine ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis model. J Thromb Haemost. 9 (9), 1862-1863 (2011).
- Wang, X., Xu, L. An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research. Thromb Res. 115 (1-2), 95-100 (2005).
- Tseng, M. T., Dozier, A., Haribabu, B., Graham, U. M. Transendothelial migration of ferric ion in FeCl3 injured murine common carotid artery. Thromb Res. 118 (2), 275-280 (2006).
- Bonnard, T., et al. Leukocyte mimetic polysaccharide microparticles tracked in vivo on activated endothelium and in abdominal aortic aneurysm. Acta Biomater. 10 (8), 3535-3545 (2014).
- Boulaftali, Y., Lamrani, L., et al. The mouse dorsal skinfold chamber as a model for the study of thrombolysis by intravital microscopy. Thromb Haemost. 107 (5), 962-971 (2012).
- Konstantinides, S., Schäfer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103 (4), 576-583 (2001).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1 (1), 50-55 (2013).
