Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Summary

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Abstract

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Introduction

A avaliação das características do ciclo celular e alterações que ocorrem nas células durante a progressão do ciclo celular é fundamental para a compreensão de diversos aspectos da biologia, particularmente biologia do cancro. Muitos agentes em desenvolvimento para o tratamento de doenças malignas têm efeitos profundos sobre a progressão do ciclo celular ou induzir a morte de células através do ciclo celular dependente de mecanismos. A fim de estudar a dinâmica do ciclo celular ou células numa fase específica do ciclo celular, é usual para sincronizar as células. No entanto os métodos de sincronização pode ter efeitos prejudiciais sobre as células a ser estudada, potencialmente confundindo os resultados obtidos. ¹ análise Recentemente, a utilização de proteínas marcadas com fluorescência que só estão presentes em fases específicas do ciclo de células têm permitido da progressão do ciclo celular em células individuais ao longo do tempo ^2, no entanto as células a serem estudadas necessidade de ser geneticamente manipuladas para expressar estas proteínas marcadas, o que limita a sua utilização para sistemas em que este pode ser lidoily alcançado.

O ciclo celular consiste de duas fases activas: a fase de síntese (s), onde o DNA é replicado e mitose (M), onde ocorre a divisão celular. Estas fases são separadas por três fases de hiato, ₀ G, G ₁ e G _2. G ₀ ou quiescência, é uma fase de repouso, onde a célula tem deixado o ciclo, L é _um onde as células aumentam de tamanho antes da replicação de ADN e L _2, onde o crescimento celular continua entre a conclusão da replicação de ADN, mas antes da divisão celular. A progressão através do ciclo celular é controlado por um número de pontos de verificação. O G ₁ ponto de verificação é ativada quando as condições ambientais não são favoráveis ​​a síntese de DNA e impede a entrada na fase S. O intra-S fase checkpoint ou atraso pode ser desencadeada por danos no DNA que pode resultar em forquilhas de replicação paralisadas. Durante G ₂ a fidelidade do DNA replicado é confirmada e se o dano for detectado, em seguida, o _G2 </sub> ponto de verificação é ativada permitindo o reparo do DNA antes da divisão celular. Um ponto de verificação final durante a mitose assegura que os cromatídeos foram correctamente alinhado com a placa mitótico modo que a divisão celular pode ser completada com êxito. ³ A activação destes pontos de verificação é normalmente usado para sincronizar as populações de células. Checkpoints do ciclo celular pode ser activada por um número de factores, mas na biologia do cancro a mais comum é a detecção de danos no DNA. A resposta a danos no ADN é iniciada pela PI3-quinase-quinases como ataxia e telangiectasia Rad3 relacionado (ATR) e a ataxia telangiectasia mutada (ATM) que activam as cinases efectoras a jusante Chk1 e Chk2, respectivamente. ³ Uma série de eventos activa Chk1 incluindo parado forquilhas de replicação, ligações cruzadas de DNA e danos da radiação ultravioleta enquanto Chk2 é ativado principalmente por quebras de cadeia dupla.

O método usual para estudar o efeito de condições alteradas no comprimento do ciclo celular is para sincronizar as células numa fase específica do ciclo celular. ¹ Isto pode ser alcançado através de vários métodos. As células podem ser fisicamente separadas com base no tamanho, densidade, dispersão lateral (granulosidade), e expressão de marcadores de superfície celular. Mais praticamente, as células podem ser sincronizado por meios químicos. Vários agentes, tais como timidina, hidroxiureia e arabinósido de citosina podem ser utilizados para inibir a síntese de ADN em fase S do ciclo celular, resultando numa acumulação de células em fase S que continuam ciclismo após os agentes são removidos. As células tratadas com nocodazole, o que impede a formação do fuso mitótico, parada com uma L ₂ – ou M-fase teor de ADN. Eliminação do soro do meio de cultura resulta na acumulação de células na fase G _0. A re-adição de nutrientes dentro das séricos cultura re-inicia o ciclo normal das células. No entanto, todos esses métodos de sincronização interferir com ciclos normais e o crescimento de células e pode Result em morte celular significativa.

A sincronização das células de leucemia linfoblástica aguda é particularmente difícil e estas células não são passíveis de manipulação genética. O método aqui descrito permite a avaliação da dinâmica do ciclo celular e o estudo de células em fases específicas do ciclo celular, sem sincronização tradicional ou modificação genética. Este método também pode ser útil para outros tipos de células em que a modificação genética e procedimentos de sincronização tradicionais não são prontamente obtidos. O método baseia-se no uso há muito estabelecida de bromodesoxiuridina (BrdU) a incorporação, o que tem muito pouco impacto sobre o crescimento a curto prazo e a proliferação de células. ⁴ protocolos BrdU Estabelecida tirar vantagem da incorporação de BrdU no ADN sintetizado de novo durante a fase S . Isto marca permanentemente células como estando em fase S durante a exposição BrdU. Esta população pode ser identificado em pontos de tempo mais tardios por coloração para BrdU Incorporção e, assim, agir como uma população sincronizados que podem ser seguidos e avaliados ao longo do tempo permitindo o estudo dos efeitos da droga sobre o trânsito do ciclo celular. BrdU precisa de ser exposto antes da coloração do anticorpo, geralmente atingidos após a ADNase ou tratamento ácido. ^6,7 utilizando citometria de fluxo para detectar BrdU incorporada possibilita a inclusão de marcadores adicionais. O mais importante é a utilização de corantes para medir o teor de ADN, permitindo a avaliação da distribuição de fases do ciclo celular das células que estavam na fase S no início do estudo. ⁸ antigénios de superfície ou intracelulares adicionais Além disso, também pode ser estudada. ⁹ Estes pode referir-se os eventos do ciclo celular, tais como Ki67 ou características celulares para aparentemente não relacionadas, tais como marcadores de apoptose como a caspase-3 clivada. As aplicações potenciais são limitadas pela imaginação do investigador.

Protocol

O protocolo aqui descrito utiliza a linha celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 mas pode ser aplicada a outros tipos de células. 1. Soluções e Reagentes RPMI completo Adicionar 56 ml de soro fetal de vitelo (FCS) e 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a um frasco de 500 ml de meio RPMI-1640. BrdU da Solução Prepare 32,5 mM de BrdU (10 mg / ml) em fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS). BrdU compl…

Representative Results

Esta metodologia pode ser utilizada para obter uma gama de informações. Alguns aplicativos são descritas aqui. Avaliação da duração do ciclo celular Para determinar o tempo necessário para que as células de trânsito através do ciclo celular, as células são colhidas em vários pontos de tempo após o pulso de BrdU. Os intervalos entre as avaliações pode ser adaptado para as células particulares a serem analisadas. Linhas de células hematopoiética…

Discussion

A capacidade de analisar o ciclo celular é importante para a compreensão da biologia do cancro e o mecanismo de acção de ambas as drogas e os genes que influenciam a proliferação das células e o crescimento. Embora haja um grande número de ensaios que medem a proliferação celular supostamente, a maioria só fornecem uma medida que indica as células Número presente. Estes incluem ensaios que medem o número de células por visualização direta e contando, atividade metabólica ou concentração de ATP. A pri…

Materials

APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Referred to as Wash buffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fetal Bovine Serum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150cm2 vented Flasks	BD Biosciences	355001
Pipettes 25mL	Greiner	760180
Aersol Pipettes 200µL	Interpath	24700
Aersol Pipettes 1mL	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 incubator	Binder	C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128