Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización
Summary
Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.
Abstract
This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.
Introduction
La evaluación de las características del ciclo celular y los cambios que se producen en las células durante la progresión del ciclo celular es fundamental para la comprensión de muchos aspectos de la biología, en particular la biología del cáncer. Muchos agentes en desarrollo para el tratamiento de tumores malignos tienen efectos profundos sobre la progresión del ciclo celular o inducir la muerte celular a través del ciclo celular dependiente de mecanismos. Con el fin de estudiar la dinámica del ciclo celular o células en una fase particular del ciclo celular, es habitual para sincronizar las células. Sin embargo métodos de sincronización pueden tener efectos perjudiciales sobre las células que se estudian, potencialmente confundiendo a los resultados obtenidos. 1 análisis Recientemente, el uso de proteínas etiquetadas con fluorescencia que sólo están presentes en fases particulares del ciclo de las células han permitido de la progresión del ciclo celular en las células individuales a través del tiempo 2, sin embargo las células a ser estudiadas necesidad de ser manipulados genéticamente para expresar estas proteínas etiquetadas, lo que limita su uso a sistemas en los que esto puede ser leidoslia logrado.
El ciclo celular consiste de dos fases activas: la fase de síntesis (S), donde se replica el ADN y la mitosis (M), donde la división celular tiene lugar. Estas fases están separadas por tres fases gap, G 0, G 1 y G 2. G 0 o quiescencia, es una fase de reposo donde la célula ha dejado el ciclo, G 1 es donde las células aumentan de tamaño antes de la replicación del ADN y G 2, donde el crecimiento celular continúa entre la terminación de la replicación del ADN pero antes de la división celular. La progresión a través del ciclo celular está controlada por un número de puntos de control. El G 1 puesto de control se activa cuando las condiciones ambientales no son de apoyo de la síntesis de ADN e impide la entrada en fase S. El puesto de control de fase intra-S o el retraso pueden ser provocados por daños en el ADN que puede resultar en las horquillas de replicación estancado. Durante G 2 la fidelidad de la ADN replicado se confirma y si se detecta daño, entonces el G 2 </sub> puesto de control se activa permitiendo la reparación del ADN antes de la división celular. Un punto de comprobación final durante la mitosis asegura que cromátidas se han alineado correctamente en la placa mitótico de modo que la división celular se puede completar con éxito. 3 La activación de estos puntos de control se utiliza comúnmente para sincronizar las poblaciones de células. Los puntos de control del ciclo celular pueden ser activados por un número de factores, pero en la biología del cáncer el más común es la detección de daños en el ADN. La respuesta al daño del ADN se inicia por la PI3-quinasa quinasas ataxia y telangiectasia Rad3 relacionados (ATR) y ataxia telangiectasia mutada (ATM) que activan las quinasas efectoras aguas abajo Chk1 y Chk2, respectivamente. 3 Una serie de eventos se activa Chk1 incluyendo estancado horquillas de replicación, entrecruzamientos de ADN, y el daño por radiación ultravioleta, mientras que Chk2 se activa principalmente por roturas de doble hebra.
El método usual para estudiar el efecto de las condiciones alteradas de la longitud de la i ciclo celulars para sincronizar las células en una fase particular del ciclo celular. 1 Esto puede lograrse a través de varios métodos. Las células pueden separarse, físicamente basan en el tamaño, densidad, dispersión lateral (granularidad), y marcadores de expresión de la superficie celular. Más prácticamente, las células pueden ser sincronizados por medios químicos. Varios agentes tales como la timidina, la hidroxiurea y arabinósido de citosina se pueden utilizar para inhibir la síntesis de ADN en la fase S del ciclo celular que resulta en una acumulación de células en fase S que siguen ciclismo después se eliminan los agentes. Las células tratadas con nocodazol, que previene la formación del huso mitótico, arresto con un G 2 – o M-fase el contenido de ADN. Eliminación de suero a partir de los resultados de medio de cultivo en la acumulación de células en G 0 fase. El re-adición de los nutrientes dentro de las séricos cultura re-inicia el ciclo normal de las células. Sin embargo, todos estos métodos de sincronización interfieren con el ciclo normal y crecimiento de las células y puede Result en la muerte celular significativa.
Sincronización de las células de la leucemia linfoblástica aguda es particularmente difícil y estas células no son susceptibles a la manipulación genética. El método aquí descrito permite la evaluación de la dinámica del ciclo celular y el estudio de células en fases particulares del ciclo celular sin sincronización tradicional o modificación genética. Este método también puede ser útil para otros tipos de células que no se consigue fácilmente la modificación genética y los procedimientos de sincronización tradicionales. El método se basa en el uso a largo establecido de bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación, que tiene muy poco impacto en el crecimiento a corto plazo y la proliferación de las células. 4 protocolos establecidos BrdU toman ventaja de la incorporación de BrdU en el ADN recién sintetizado durante la fase S . Esto marca permanentemente las células como haber estado en la fase S durante la exposición BrdU. Esta población puede ser identificado en los puntos de tiempo posteriores por tinción para incor BrdUación y por lo tanto actúan como una población sincronizada que puede ser seguido y evaluado con el tiempo lo permite el estudio de los efectos del fármaco sobre el tránsito del ciclo celular. BrdU necesita ser expuesta antes de la tinción de anticuerpos, por lo general realizados a raíz de DNasa o tratamiento ácido 6,7. El uso de la citometría de flujo para detectar BrdU incorporado permite la inclusión de marcadores adicionales. El más importante es el uso de tintes para medir el contenido de ADN, lo que permite la evaluación de la distribución de fase del ciclo celular de las células que estaban en fase S en el inicio del estudio. 8 de superficie o intracelulares antígenos Además adicionales también pueden ser estudiados. 9 Estos pueden estar relacionados con los eventos del ciclo celular, como Ki67 o funciones celulares para aparentemente no relacionados, tales como marcadores de apoptosis como exfoliados caspasa-3. Las posibles aplicaciones están limitadas por la imaginación del investigador.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de analizar el ciclo celular es importante para la comprensión de la biología del cáncer y el mecanismo de acción de ambos fármacos y genes que influyen en la proliferación celular y el crecimiento. Mientras que hay una multitud de ensayos que miden la proliferación de células según se informa, la mayoría sólo proporciona una medida que indica las células número presente. Estos incluyen ensayos que miden el número de células por visualización directa y el recuento, la actividad metabólica o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).
Materials
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25mL | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200µL | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1mL | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
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