Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Ziekten van de integriteit van het ruggenmerg motorneuronen behoren tot de meest slopende neurologische aandoeningen. In de afgelopen decennia is de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen van deze neuromusculaire stoornissen gegeven wetenschappers met verschillende therapeutische's ter vertragen of omkeren van de progressie van deze aandoeningen. Door gebruik te maken van de retrograde machinerie van neuronen, één van deze benaderingen is om skeletspieren om shuttle therapeutische genen te richten op overeenkomstige ruggenmerg motorneuronen. Maar zodra veelbelovend is het succes van dergelijke gentherapie benadering belemmerd door het sub-optimale aantal getransduceerde motorneuronen zij tot dusver getoond verkregen. Motorzijde platen (EP) zijn zeer gespecialiseerde gebieden op de skeletmusculatuur die in direct contact synaptische het ruggenmerg α motorische neuronen. In dit verband is het belangrijk op te merken dat, tot nu toe, de inspanningen om retrogradelyoverdracht van genen in motorische neuronen plaats tegen de locatie van het gebied MEP in de beoogde spieren. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol 1) om de exacte locatie van de EP-leden op het oppervlak van de skeletspieren te onthullen en 2) om deze informatie gebruiken om te begeleiden de intramusculaire levering en daaropvolgende optimale retrograde transport van retrograde tracers in motorische neuronen. We hopen de resultaten van deze tracing experimenten in verdere studies te gebruiken in het onderzoek naar retrograde transport van therapeutische genen aan het ruggenmerg motorische neuronen door de doelgerichtheid van Europarlementsleden.
Introduction
Het verlies van de controle van vrijwillige bewegingen als gevolg van neurologische aandoeningen zoals motorneuron ziekte en spinal- en Duchenne musculaire atrofie is een invaliderende aandoening die hoge en langdurige gevolgen voor het dagelijks leven van aangetaste individuen heeft. In de afgelopen tien jaar heeft onderzoek gericht om te stoppen of op zijn minst vertraging van de schadelijke effecten van deze neuromusculaire ziekten een prioriteit voor veel artsen en wetenschappers over de hele wereld. In dit verband heeft de recente generatie diermodellen deze neuromusculaire aandoeningen nabootsen die nodig was om fundamenteel inzicht in de fysiologische mechanismen verantwoordelijk voor de ontwikkeling en progressie van deze voorwaarden zijn 1-13. Behandeling van deze neuromusculaire aandoening heeft directe toegang tot het ruggenmerg en kan door ruggenmerg injecties 14,15. Recente ontwikkelingen in gentherapie zijn ook gericht op de dwarsgestreepte spieren van de bovenste enonderste ledematen shuttle therapeutische genen tot de overeenkomstige α motorische neuronen die zich in de ventrale hoorn van het ruggenmerg 1,9-13. Echter, deze keer veelbelovende strategie niet aan de uitkomst van deze neurologische aandoeningen te verbeteren. Hoewel het worden besloten dat deze slechte resultaten kan zijn, althans gedeeltelijk, te wijten aan de lage doeltreffendheid van deze beschermende genen, kan men de lage werkzaamheid van deze genafgifte te passen niet uit.
End motor platen (EP) zijn gespecialiseerde gebieden van het skelet myofibrillen die worden ingesprongen door de axon terminals van grote perifere motorische vezels afkomstig uit α motorische neuronen. Samen vormen de perifere zenuw vezel uiteinden en EP vormen de neuromusculaire junctie, dat wil zeggen de plaats waar synaptische impulsen worden veroorzaakt door de anterograde afgifte van de neurotransmitter, acetylcholine. Belangrijk is dat de relatie tussen perifere zenuwvezels en de leden van het EP is bi-direcnele, hoewel de verschillende motoren zijn verantwoordelijk voor het transport van moleculen en organellen richting en weg van het neuron somata 16-18. In het licht van deze anatomische overwegingen, Europarlementsleden lijken om de doelstellingen van de keuze voor de levering en daaropvolgende retrograde transport van genetisch materiaal naar de overeenkomstige motorische neuronen. In dit verband is het niet verrassend dat het succes van motor neuron transductie sterk afhankelijk van de afstand tussen de intramusculaire injectie van virale vectoren en spier EP 19-20. Verrassenderwijs echter, de exacte locatie van het MEP zones op de myofibrillen van het laboratorium rat en muis, de twee species gekozen model neuromusculaire ziekten beschikbaar waren tot voor kort.
We hebben uitgebreide kaart van de omgeving MEP enkele voorpoot spieren in de rat en de muis 21-22 geproduceerd. Recenter hebben we aangetoond details van de organisatie van het MEP rEgion voor meerdere spieren van de muis achterbeen 23 en we zijn momenteel het analyseren van de kenmerken van de leden van het EP op het achterbeen rat. In onze handen, intramusculaire injecties van retrograde tracers gericht op het gehele MEP zones in deze spieren leidde tot meer gelabelde motorneuronen die van meer ruggenmergsegmenten dan eerder gerapporteerd. Hier presenteren we het protocol dat is ontwikkeld in de afgelopen jaren om de locatie van de EP op het buitenoppervlak en over de hoogte van het achterbeen onthullen en voorpoot spieren in zowel de muis en de rat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intramusculaire targeting en daaropvolgende retrograde overbrengen van therapeutische transgenen in het overeenkomstige α motoneuronen voor de experimentele behandeling van neuromusculaire aandoening geen nieuwe strategie. Zo heeft deze levering methode gebruikt om neuromusculaire degeneratie vertraging in verschillende stadia van de progressie van ALS SOD1 muizen en ratten 1,9-12 en in muizen met SMA 13. Ofschoon veelbelovend, is de effectiviteit van deze gentherapie scenario beperkt. In dit verb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een National Health & Medisch Centrum voor Onderzoek (NHMRC) project subsidie aan RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. 신경과학. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. 신경과학. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
