Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Doenças que afetam a integridade da medula espinhal neurônios motores estão entre as doenças neurológicas mais debilitantes. Durante as últimas décadas, o desenvolvimento de vários modelos animais destas doenças neuromusculares forneceu a comunidade científica com cenários terapêuticos diferentes destinadas a retardar ou inverter a progressão destas condições. Tirando partido da maquinaria retrógrada de neurónios, uma destas abordagens tem sido a alvejar os músculos esqueléticos, a fim de genes terapêuticos de transporte em correspondentes neurónios motores da medula espinal. Embora uma vez promissora, o sucesso da abordagem de entrega de tal gene tem sido dificultada pelo número sub-ótimo de neurônios motores transduzidas até agora tem mostrado a ceder. Placas motoras (MPE) são regiões altamente especializados na musculatura esquelética que estão em contato direto sináptica para a medula espinhal α neurônios motores. A este respeito, é importante notar que, até agora, os esforços para retrogradamentegenes transferência para os neurônios motores foram feitas sem referência à localização da região de MEP nos músculos alvo. Aqui, descrevemos um protocolo simples 1) para revelar a localização exata dos deputados na superfície dos músculos esqueléticos e 2) usar esta informação para guiar a entrega intramuscular e transporte retrógrado ideal subsequente de traçadores retrógrados em neurônios motores. Esperamos utilizar os resultados desses experimentos de rastreamentos em novos estudos sobre investigando transporte retrógrado de genes terapêuticos para os neurônios motores da coluna vertebral cabo através da segmentação dos deputados.
Introduction
A perda de controle do movimento voluntário que resulta de condições neurológicas, como a doença do neurônio motor e spinal-, bem como atrofia muscular de Duchenne é uma condição debilitante que tem um impacto elevado e duradouro na vida todos os dias dos indivíduos afetados. Durante a última década, os esforços de pesquisa com o objetivo de parar ou pelo menos retardar os efeitos deletérios dessas doenças neuromusculares tem sido uma prioridade para muitos médicos e cientistas de todo o mundo. A este respeito, a recente geração de modelos animais que imitam estas doenças neuromusculares foi essencial na obtenção de conhecimentos fundamentais sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes ao desenvolvimento e à progressão destas condições 1-13. O tratamento destas doenças neuromusculares requer acesso directo à medula espinal e pode ser conseguida através de injecções na medula espinhal 14,15. Os recentes avanços na terapia genética também têm como alvo os músculos estriados do superior emembros inferiores a genes terapêuticos de transporte para os neurônios motores α correspondentes que estão localizados dentro do corno anterior da medula espinhal 1,9-13. No entanto, esta estratégia promissora uma vez não conseguiu melhorar o resultado dessas condições neurológicas. Embora seja justo concluir que estes resultados pobres poderia ser, pelo menos em parte, ser atribuída à baixa eficácia destes genes protetores, não se pode excluir a baixa eficácia destes métodos de entrega de genes.
Placas motoras (MPE) são regiões especializadas das miofibras esqueléticos que são recuados pelos terminais do axônio de grandes fibras motoras periféricas provenientes de α neurônios motores. Em conjunto, as terminações de fibras nervosas periféricas e os eurodeputados formar a junção neuromuscular, ou seja, o local onde os impulsos sinápticos são desencadeadas pela libertação anterógrada do neurotransmissor, acetilcolina. Importante, a relação entre as fibras nervosas periféricas e os eurodeputados é bi-direccional, embora diferentes motores são responsáveis pelo transporte de moléculas e organelas, bem como no sentido para longe do neurónio somata 16-18. À luz dessas considerações anatômicas, os deputados parecem ser os alvos de escolha para a entrega e transporte retrógrado subsequente de material genético para os neurônios motores correspondentes. Neste contexto, não é surpreendente que o sucesso da transdução de neurónio motor depende muito da distância entre a injecção intramuscular de vectores virais e do PE do músculo 19-20. Surpreendentemente, no entanto, a localização exacta das zonas de MEP nos miofibras do rato de laboratório e do rato, as duas espécies de escolha para modelar doenças neuromusculares, não estavam disponíveis até recentemente.
Temos produzido mapas detalhados da região do MEP para vários músculos forelimb no rato eo rato 21-22. Mais recentemente, nós mostramos os detalhes da organização do MEP region por vários músculos do membro posterior do rato 23 e estamos actualmente a analisar as características dos deputados do Parlamento Europeu sobre o membro posterior de ratos. Em nossas mãos, injeções intramusculares de traçadores retrógrados dirigidos às zonas inteiras MEP nestes músculos deu origem a neurônios motores mais marcadas que estão abrangendo segmentos da medula espinhal mais do que o relatado anteriormente. Aqui apresenta-se o protocolo que tem sido desenvolvida ao longo dos últimos anos a revelar a localização dos eurodeputados na superfície externa, bem como em toda a profundidade do membro posterior e músculos do membro anterior, tanto no rato e na ratazana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Segmentação intramuscular e subsequente transferência de transgenes retrógrada terapêuticas para os correspondentes neurónios motores α para o tratamento experimental da condição neuromuscular não é uma nova estratégia. Por exemplo, este método de entrega tem sido usado para retardar a degenerescência neuromuscular em diferentes fases da progressão de ALS em ratinhos e ratos SOD1 1,9-12, bem como em ratinhos com SMA 13. Embora promissora, a eficácia destes cenários de terapia de ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um Centro de Pesquisa Nacional de Saúde e cuidados médicos (NHMRC) subvenção de projecto para RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
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