माउस मस्तिष्क के पार्श्व निलय में Ependymal पक्ष्माभिका का लाइव इमेजिंग
Summary
उच्च संकल्प अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, माउस मस्तिष्क निलय के भीतर स्थित गतिशील ependymal सिलिया की पिटाई की एक पूर्व vivo अवलोकन रहते इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन किया है। तकनीक के लिए एक अनूठा सिलिअरी पिटाई आवृत्ति की रिकॉर्डिंग और पिटाई के कोण के साथ ही उनके intracellular कैल्शियम दोलन पेसिंग गुणों की अनुमति देता है।
Abstract
Multiciliated ependymal कोशिकाओं वयस्क मस्तिष्क में निलय लाइन। असामान्य समारोह या ependymal सिलिया की संरचना विभिन्न न्यूरोलॉजिकल घाटे के साथ जुड़ा हुआ है। गतिशील ependymal सिलिया तकनीक के पूर्व vivo रहते इमेजिंग वर्तमान में कई चरणों का पालन सिलिअरी गतिशीलता का एक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इन चरणों में शामिल हैं: चूहों कार्बन डाइऑक्साइड के साथ इच्छामृत्यु टोलेडो के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय के प्रोटोकॉल के अनुसार; एक vibratome या तेज ब्लेड के साथ मस्तिष्क को हटाने और बाण के समान मस्तिष्क विच्छेदन द्वारा पीछा craniectomy ependymal सिलिया देखे जा सकते हैं, जहां मस्तिष्क पार्श्व निलय, के माध्यम से बहुत पतली वर्गों को प्राप्त करने के लिए। 95% / 5% हे की उपस्थिति में 2 / सीओ 2 मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / उच्च ग्लूकोज युक्त एक स्वनिर्धारित गिलास नीचे थाली में मस्तिष्क के स्लाइस की ऊष्मायन जीवित ऊतक रखने के लिए आवश्यक है दौरानप्रयोग। सिलिया धड़कन का एक वीडियो तो एक उच्च संकल्प अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज की गई है। वीडियो तो सिलिअरी पिटाई आवृत्ति की गणना करने के फ्रेम से फ्रेम का विश्लेषण किया जाता है। यह उनकी सिलिअरी पिटाई आवृत्ति और कोण के आधार पर तीन श्रेणियों या प्रकारों में ependymal कोशिकाओं के अलग वर्गीकरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक ependymal कोशिकाओं की अनूठी intracellular कैल्शियम दोलन गुणों के साथ-साथ कैल्शियम दोलनों पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव और रोमक पिटाई आवृत्ति चिह्नित करने के लिए उच्च गति प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण के उपयोग की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक सिलिअरी संरचना और रोमक प्रोटीन स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए immunofluorescence इमेजिंग के लिए उपयुक्त है। इस रोग के निदान और phenotype के अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क के ऊतकों को मरने के लिए शुरू होता है के रूप में तकनीक की मुख्य सीमा लाइव गतिशील सिलिया आंदोलन में कमी करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है।
Introduction
Cilia बाह्य वातावरण को कोशिका की सतह से करता हूं कि संवेदी सूक्ष्मनलिका आधारित अंगों हैं। "9 + 0" या "9 + 2" – अपने सूक्ष्मनलिका संगठन पर निर्भर करता है, सिलिया दो प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है। कार्यात्मक, उनकी गतिशीलता के आधार पर, इन गतिशील या गैर गतिशील सिलिया 1 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। प्राथमिक सिलिया सामान्यतः "9 + 0" गैर गतिशील सिलिया निरूपित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ये ('9' से चिह्नित) नौ समानांतर नक़ल सूक्ष्मनलिकाएं है और सूक्ष्मनलिकाएं के एक केंद्रीय जोड़ी ('0' से चिह्नित) केंद्रीय म्यान के भीतर अनुपस्थित है। हालांकि, भ्रूण laterality विनियमित जो इस तरह के नोडल सिलिया के रूप में कुछ "9 + 0" सिलिया, 2 गतिशील होते हैं। दूसरी ओर, गतिशील सिलिया सूक्ष्मनलिका दोहरी की अतिरिक्त केंद्रीय जोड़ी ने नौ समानांतर सूक्ष्मनलिका दोहरी के अलावा, विशेषता है और गतिशीलता की सुविधा के लिए dynein मोटर प्रोटीन के साथ जुड़े। इसके अलावा, कुछ "9ऐसे घ्राण सिलिया के रूप में दो "सिलिया 3 गैर गतिशील होते हैं। मस्तिष्क निलय और रीढ़ की हड्डी के मध्य नहर अस्तर Ependymal कोशिकाओं मस्तिष्क निलय 4 साथ मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) प्रेरित करना है कि गतिशील सिलिया की विशेषता है।
इस विधि के समग्र लक्ष्य सिलिया की गतिशीलता और संरचनात्मक असामान्यताओं गतिशील का अध्ययन की सुविधा के लिए है। मस्तिष्क के स्वास्थ्य और विकास को भारी मस्तिष्क निलय के भीतर सीएसएफ के कुशल संचलन पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, सामान्य सीएसएफ प्रवाह और तरल पदार्थ संतुलन सामान्य पिटाई और बदले में neuronal कोशिकाओं की दिशात्मक आंदोलन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेल प्रवास 7 स्टेम जो कार्यात्मक ependymal सिलिया 5,6, की आवश्यकता होती है। इस तरह, असामान्य ependymal सिलिया समारोह या जलशीर्ष के साथ जुड़ा हुआ है, जो असामान्य सीएसएफ प्रवाह, को जन्म दे सकता संरचना के रूप में, एक चिकित्सा शर्त है जिसमें बी के निलय में सीएसएफ के एक असामान्य संग्रह नहीं हैबारिश। इस फलस्वरूप intracranial दबाव और सिर, ऐंठन, सुरंग दृष्टि से प्रगतिशील वृद्धि, और मानसिक विकलांगता 8 बढ़ सकता है।
मौजूदा तरीकों पर इस तकनीक का लाभ यह तीन अलग ependymal प्रकार की कोशिकाओं रिपोर्ट करने के लिए पहली बार के लिए अनुमति दी है कि: मैं उनके अद्वितीय सिलिअरी पिटाई आवृत्ति और कोण की धड़कन के आधार पर द्वितीय और तृतीय,। ये ependymal कोशिकाओं मस्तिष्क निलय में कुछ क्षेत्रों के भीतर स्थानीयकृत हैं। इसके अलावा, उम्र और जैसे शराब और ependymal प्रकार की कोशिकाओं या उनके localizations के फेरबदल पर cilostazol के रूप में औषधीय एजेंटों के प्रभाव ependymal कोशिकाओं के इस वर्गीकरण से पहले संभव नहीं था, जो प्रदर्शन किया जा सकता है। Cilostazol फॉस्फोडाइस्टरेज़-3 के एक अवरोध करनेवाला, एएमपी शिविर metabolizes कि एक एंजाइम है और यह भी intracellular कैल्शियम 9 नियंत्रित करता है। उच्च गति प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण का प्रयोग अनूठा इंट्रासेल्युलर की इमेजिंग और बढ़ाता की अनुमति देता हैependymal कोशिकाओं के कैल्शियम दोलन गुण। उदाहरण के लिए, शराब और cilostazol दोनों काफी बदले में, ependymal सिलिया 10 से मस्तिष्कमेरु द्रव की मात्रा प्रतिस्थापन में बदलाव के लिए ले जा सकता है जो ependymal सिलिअरी पिटाई आवृत्ति के रूप में अच्छी तरह से intracellular कैल्शियम दोलनों गुण, बदल दिया। सारांश में, इस तकनीक को विभिन्न कैल्शियम दोलन गुणों के साथ ependymal कोशिकाओं के तीन अलग-अलग प्रकार का पहला सबूत प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण था।
निम्न अनुभाग में, प्रक्रिया का विस्तृत कदम दर कदम सिंहावलोकन ऊतक तैयारी और से निपटने के लिए करीब ध्यान दे, प्रदान की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लाइव-इमेजिंग और मस्तिष्क निलय के भीतर ependymal सिलिया की एक तेजी से और संवेदनशील करीब अवलोकन प्रदान करता है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए माउस मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल य…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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