Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-
Summary
Mit hochauflösenden Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie wird eine ex vivo Beobachtung des schlagenden motiler ependymaler Zilien innerhalb der Maus Hirnkammern entfernt von Live-Bildgebung nachgewiesen. Die Technik ermöglicht eine Aufnahme von der einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel sowie deren intrazellulären Calcium-Oszillation Stimulationseigenschaften.
Abstract
Multiciliated Ependymzellen säumen die Ventrikel im erwachsenen Gehirn. Abnormale Funktion oder Struktur ependymaler Zilien ist mit verschiedenen neurologischen Defiziten assoziiert. Die aktuelle ex vivo Echtzeit-Bildgebung von beweglichen ependymaler Zilien Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Dynamik ciliary folgenden mehreren Schritten. Diese Schritte umfassen: Mäuse Euthanasie mit Kohlendioxid nach Protokollen der University of Toledo Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC); Kraniektomie gefolgt von Gehirnentfernung und sagittal Gehirn Dissektion mit einem Vibratom oder scharfe Klinge sehr dünne Schnitte durch die Hirn Seitenventrikel, wo die ependymaler Zilien visualisiert werden können erhalten. Inkubation der Scheiben des Gehirns in einem angepassten Glasbodenplatte, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose bei 37 ° C in Gegenwart von 95% / 5% O 2 / CO 2 -Gemisch ist wichtig, um das Gewebe am Leben zu halten währenddas Experiment. Ein Video der Zilien schlagen wird dann mit Hilfe eines hochauflösenden Differentialinterferenzkontrastmikroskop erfasst. Das Video wird dann Bild für Bild analysiert, um die Zilienschlag Frequenz zu berechnen. Auf diese Weise können unterschiedliche Einstufung der Ependymzellen in drei Kategorien oder Arten auf der Grundlage ihrer Zilienschlag Frequenz und Winkel. Weiterhin ermöglicht diese Technik die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildanalyse, um die einzigartigen intrazellulären Calciumschwingungseigenschaften Ependymalzellen sowie die Wirkung von pharmakologischen Mitteln auf den Calcium Schwingungen und Zilienschlag Frequenz charakterisieren. Außerdem eignet sich dieses Verfahren für Immunfluoreszenz-Bildgebung zum ziliaren Struktur und ciliary Proteinlokalisationsstudien. Dies ist besonders wichtig bei der Krankheitsdiagnose und Phänotyp Studien. Die Hauptbeschränkung der Technik wird auf die Abnahme in lebenden motile Zilien Bewegung zurückzuführen, wie das Hirngewebe und sterben ab.
Introduction
Cilien sensorischen Mikrotubulus-basierten Organellen, die von der Zelloberfläche an die extrazelluläre Umgebung zu verlängern. "9 + 0" oder "9 + 2" – je nach ihrer Mikrotubuliorganisationszentrum kann Zilien in zwei Typen eingeteilt werden. Funktionell bezogen auf ihre Beweglichkeit, so können diese als bewegliche oder unbewegliche Zilien 1 eingestuft werden. Primäre Zilien ist ein Begriff allgemein verwendet, bezeichnen "9 + 0" unbewegliche Zilien. Diese haben neun parallelen Dublett Mikrotubuli (hergestellt von "9" bezeichnet) und einer zentralen Paar von Mikrotubuli abwesend innerhalb der zentralen Hülse (durch "0" bezeichnet). , Einige "9 + 0" Zilien, wie Knoten Zilien, die Lateralität Embryo regulieren sind jedoch beweglich 2. Auf der anderen Seite, motile Cilien gekennzeichnet, daß zusätzlich zu den neun parallelen Mikrotubuli Dubletts, durch einen zusätzlichen zentralen Paar Mikrotubuli Dubletts und Dynein Motorproteinen assoziiert Motilität erleichtern. Darüber hinaus sind einige "9+2 "Cilien wie olfaktorische Zilien sind unbewegliche 3. Ependymzellen entlang der Hirnkammern und den Zentralkanal des Rückenmarks durch bewegliche Zilien, die den Liquor (CSF) entlang der Hirnkammern 4 zu treiben ist.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erleichterung der Untersuchung der bewegliche Zilien Dynamik und strukturelle Anomalien. Gesundheit und Entwicklung des Gehirns stark von effizienten Verkehr von CSF in die Hirnkammern. Zum Beispiel normaler CSF Strömung und Flüssigkeitshaushalt erfordern normale Schläge und funktionellen ependymal Zilien 5,6, was wiederum eine entscheidende Rolle spielen bei der Regulierung der Bewegungsrichtung des neuronalen Zellen und Stammzellmigration 7. Als solche abnormale ependymal Zilien Funktion oder Struktur können zu abnorm CSF Strömung, die mit Hydrocephalus ist Blei, ein medizinischer Zustand, in dem es eine abnormale Ansammlung von CSF in den Ventrikeln des bregen. Dies kann folglich erhöhtem Hirndruck und progressive Erweiterung der Kopf, Krämpfe, Tunnelblick und geistige Behinderung 8 verursachen.
Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Verfahren ist, dass es zum ersten Mal, um drei verschiedene ependymalen Zelltypen zu melden gestattet: I, II und III, auf der Grundlage ihrer einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel. Diese Ependymzellen innerhalb bestimmter Regionen in die Hirnkammern lokalisiert. Weiterhin können die Wirkungen des Alters und pharmakologischen Mitteln wie Alkohol und Cilostazol auf die Änderung der ependymalen Zelltypen oder ihrer Lokalisierungen nachgewiesen werden, was nicht vor dieser Klassifizierung von Ependymalzellen war möglich. Cilostazol ist ein Inhibitor der Phosphodiesterase-3, ein Enzym, das cAMP zu AMP metabolisiert wird, und regelt intrazellulärem Calcium 9. Mit High-Speed-Fluoreszenz-Imaging-Analyse ermöglicht die Abbildung und Quantifizierung der einzigartigen intrazellulärenCalcium Schwingungseigenschaften der Ependymzellen. Zum Beispiel werden sowohl Alkohol und Cilostazol deutlich die ependymaler Zilienschlag Frequenz sowie die intrazellulären Calcium-Oszillationen Eigenschaften, die wiederum könnte zu einer Veränderung in der Zerebrospinalflüssigkeit Volumenersatz von ependymaler Zilien 10 führen verändert. Zusammengefasst war diese Technik Schlüssel, um den ersten Beweis von drei verschiedenen Arten von ependymalen Zellen mit unterschiedlichen Calciumschwingungseigenschaften bereitzustellen.
Im folgenden Abschnitt wird eine ausführliche Schritt-für-Schritt-Überblick über das Verfahren zur Verfügung gestellt, aufmerksam auf Gewebe Herstellung und Handhabung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschrieben wird ein Protokoll für die Herstellung von Maus-Gehirngewebe sowohl Live-Bildgebung und die Fluoreszenzmikroskopie, die eine schnelle und empfindliche genauer Betrachtung der ependymalen Zilien in den Hirnkammern liefert. Diese Technik ist nicht nur auf den lateralen Ventrikel beschränkt; es könnte verwendet, um die Zilien in anderen Hirnkammern beobachten. Diese Bildgebungstechnik bietet einen Live-Stream, die die Bewegung des CSF von Zilienschlag in einem ex vivo-Einstellung ähnelt. Darüber h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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