Живая съемка в эпендимных ресничек боковых желудочков головного мозга мыши
Summary
Использование высокого разрешения дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии, экс естественных условиях наблюдение избиения подвижных ресничек эпендимных расположенном в желудочки головного мозга мыши демонстрируют живого изображения. Методика позволяет запись уникальной частотой цилиарного размола и угол бил, а также их внутриклеточный кальций свойства колебаний стимуляции.
Abstract
Multiciliated эпендимные клетки выстилают желудочки во взрослом мозге. Нарушение функции или структуры эпендимных ресничек связана с различными неврологическими дефицита. Тока экс естественных условиях живут изображений подвижных ресничек эпендимных техники позволяет для детального изучения динамики цилиарных после нескольких шагов. Эти шаги включают в себя: мыши эвтаназии диоксидом углерода в соответствии с протоколами университета Уходу за животными Толедо и использование комитета (IACUC); удаление фрагментов костей черепа с последующим удалением головного мозга и сагиттальном вскрытия головного мозга с vibratome или острым лезвием, чтобы получить очень тонкие срезы через боковые желудочки головного мозга, где эпендимных реснички могут быть визуализированы. Инкубация ломтиками мозга в индивидуальных стеклянным дном пластины, содержащие модифицированные Игла среды (DMEM) / High-глюкоза Дульбекко при 37 ° С в присутствии 95% / 5% O 2 / CO 2 смеси важно, чтобы ткань живых в течениеэксперимент. Видео ресничек избиения затем записываются с использованием высокого разрешения дифференциального интерференционного контрастного микроскопа. Видео затем анализируют кадр за кадром, чтобы вычислить частоту цилиарного биение. Это позволяет отличный классификацию эпендимных клеток в трех видов или категорий в зависимости от их частоты мерцательная избиения и угла. Кроме того, этот метод позволяет использовать высокоскоростной анализа флуоресцентной томографии для характеристики уникальные внутриклеточные колебаний кальция свойства эпендимных клеток, а также влияния фармакологических агентов на колебания кальция и частоту цилиарного избиение. Кроме того, этот метод подходит для иммунофлуоресценции изображений для структуры цилиарного и локализации белка мерцательная исследований. Это особенно важно в диагностике болезни и фенотипа исследований. Основным ограничением методики связано с уменьшением в живом подвижных ресничек, как движения ткани мозга начинает умирать.
Introduction
Реснички сенсорные микротрубочек на основе органеллы, которые простираются от поверхности клетки во внеклеточную среду. В зависимости от их микротрубочек организации, реснички могут быть классифицированы на два типа – "9 + 0" или "9 + 2". Функционально, в зависимости от их подвижности, они могут быть классифицированы как подвижных или неподвижных ресничек 1. Первичная ресничек термин обычно используется для обозначения "9 + 0" неподвижные реснички. Они имеют девять параллельных микротрубочек дублетные (обозначается '9') и центральная пара микротрубочек отсутствует в центральной оболочкой (обозначение «0»). Тем не менее, некоторые "9 + 0" реснички, такие как узловой ресничек, которые регулируют эмбриона латерализацию подвижны 2. С другой стороны, подвижные реснички характеризуется, в дополнение к девяти параллельных дублетов микротрубочек, дополнительным центральной пары микротрубочек дублетов и связанные с динеин моторных белков, чтобы облегчить подвижность. Кроме того, некоторые "9+2 »Реснички, такие как обонятельные реснички неподвижны 3. Эпендимных клетки, выстилающие желудочки мозга и центральный канал спинного мозга характеризуются подвижных ресничек, которые продвигают спинномозговой жидкости (ликвора) вдоль желудочков головного мозга 4.
Общая цель этого метода заключается в содействии изучению подвижных динамика реснички и структурные аномалии. Здоровье и развитие мозга в значительной степени зависят от эффективной циркуляции ликвора в желудочках головного мозга. Например, нормальный поток CSF и баланс жидкости требует нормальной избиения и функциональный эпендимных реснички 5,6, который, в свою очередь сыграть решающую роль в регулировании направленное движение нервных клеток и клеточной миграции 7 Шток. В качестве такого, ненормального эпендимных функции ресничек или структуры может привести к ненормальной потока CSF, который связан с гидроцефалией, медицинское состояние, в котором есть ненормальное накопление спинномозговой жидкости в желудочках бдождь. Это может привести к увеличению, следовательно, внутричерепное давление и прогрессивное увеличение головы, судороги, туннельное зрение, и психической инвалидности 8.
Преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, что она позволила впервые через три различных видов клеток: эпендимных I, II, III и, в зависимости от их уникальной частоте мерцательная избиения и угол бить. Эти клетки эпендимные локализованы в отдельных регионах в желудочки головного мозга. Кроме того, эффекты возраста и фармакологических агентов, таких как алкоголь и цилостазола на изменении эпендимных типов клеток или их локализации может быть продемонстрировано, что было невозможно ранее этой классификации эпендимных клеток. Cilostazol является ингибитором фосфодиэстеразы-3, фермент, который усваивает цАМФ в АМФ, и это также регулирует внутриклеточный кальций 9. Использование высокоскоростной анализ флуоресценции позволяет визуализации и количественной оценки уникального внутриклеточногоколебаний кальция свойства эпендимных клеток. Например, как алкоголь и цилостазол значительно изменили эпендимных частоту цилиарного биение, а также внутриклеточные свойства колебаний кальция, который, в свою очередь, может привести к изменению в цереброспинальной жидкости замещения объема по эпендимных ресничек 10. В целом, этот метод является ключевым, чтобы обеспечить первое доказательство трех различных типов клеток эпендимных с различными свойствами колебаний кальция.
В следующем разделе, детальное шаг за шагом обзор процедуры обеспечивается, обращая особое внимание на подготовку ткани и обработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол для подготовки ткани мозга мыши, как для живого изображения и флуоресцентной микроскопии, который обеспечивает быстрый и чувствительный тщательное наблюдение за эпендимных ресничек в желудочки головного мозга. Этот метод не ограничивается только бокового ж?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma – a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O’Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
