Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón
Summary
El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.
Abstract
Células ependimarias Multiciliated alinean los ventrículos en el cerebro adulto. Función o estructura de los cilios ependymal anormal se asocia con diversos déficits neurológicos. La corriente de imágenes ex vivo en directo de la técnica de los cilios ependymal móviles permite un estudio detallado de la dinámica ciliares siguiendo varios pasos. Estos pasos incluyen: ratones eutanasia con dióxido de carbono de acuerdo con los protocolos de la Universidad de Animal Care Institucional de Toledo y el empleo Comisión (IACUC); craniectomía seguido de la eliminación del cerebro y la disección del cerebro sagital con un vibratome o cuchilla afilada para obtener secciones muy finas a través de los ventrículos laterales del cerebro, donde los cilios ependymal puede ser visualizado. La incubación de las rebanadas del cerebro en un plato con fondo de cristal personalizado que contiene medio de Eagle modificado (DMEM) / alta glucosa de Dulbecco a 37 ° C en presencia de 95% / 5% O 2 / CO mezcla 2 es esencial para mantener vivo el tejido duranteel experimento. Un video de la paliza cilios se registra a continuación, utilizando una alta resolución de microscopio de contraste de interferencia diferencial. El vídeo se analiza a continuación, cuadro por cuadro para calcular la frecuencia de latido ciliar. Esto permite distinta clasificación de las células ependimarias en tres categorías o tipos en función de su frecuencia de latido ciliar y el ángulo. Además, esta técnica permite el uso de análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad para caracterizar las propiedades únicas intracelulares de oscilación de calcio de células ependimarias, así como el efecto de agentes farmacológicos en las oscilaciones de calcio y la frecuencia de latido ciliar. Además, esta técnica es adecuada para formación de imágenes de inmunofluorescencia para la estructura ciliar y ciliar proteína de localización de estudios. Esto es particularmente importante en los estudios de diagnóstico de enfermedades y fenotipo. La principal limitación de la técnica se atribuye a la disminución en el movimiento cilios móviles en vivo como el tejido cerebral comienza a morir.
Introduction
Los cilios son orgánulos basado-microtúbulos sensoriales que se extienden desde la superficie de la célula con el medio ambiente extracelular. Dependiendo de su nivel de organización de los microtúbulos, los cilios se pueden clasificar en dos tipos – "9 + 0" o "9 + 2". Funcionalmente, en base a su motilidad, éstos pueden ser clasificados como móviles o no móviles cilios 1. Cilios primaria es un término comúnmente utilizado para referirse a "9 + 0" cilios no móviles. Estos tienen nueve microtúbulos doblete paralelas (denotados por '9') y un par central de microtúbulos está ausente dentro de la vaina central (denotado por '0'). Sin embargo, algunos "9 + 0" cilios, como cilios nodales, que regulan la lateralidad embrionaria son móviles 2. Por otro lado, cilios móviles se caracterizan, además de los nueve dobletes de microtúbulos paralelos, por un par central adicional de dobletes de microtúbulos y se asocia con proteínas motoras dineína para facilitar la motilidad. Además, algunos "92 "cilios como cilios olfativos son no móviles 3. Las células ependimarias que recubren los ventrículos cerebrales y el canal central de la médula espinal se caracterizan por cilios móviles que propulsar el líquido cefalorraquídeo (LCR) a lo largo de los ventrículos cerebrales 4.
El objetivo general de este método es el de facilitar el estudio de la dinámica de los cilios móviles y anormalidades estructurales. La salud y el desarrollo del cerebro en gran medida dependen de la circulación eficiente de LCR dentro de los ventrículos cerebrales. Por ejemplo, el flujo de LCR normal y el equilibrio de líquidos requieren latido normal y cilios ependymal funcional 5,6, que a su vez juega un papel crítico en la regulación del movimiento direccional de las células neuronales y la migración de células madre 7. Como tal, la función de los cilios ependymal anormal o estructura puede conducir a flujo del LCR anormal, que se asocia con la hidrocefalia, una condición médica en la que hay una acumulación anormal de LCR en los ventrículos del blluvia. En consecuencia, esto puede causar un aumento de la presión intracraneal y la ampliación progresiva de la cabeza, convulsiones, visión de túnel, y la discapacidad mental 8.
Las ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes es que se permitió por primera vez a reportar tres distintos tipos de células ependimarias: I, II, y III, en función de su única frecuencia de golpeo ciliar y golpeando ángulo. Estas células ependimarias se localizan dentro de ciertas regiones de los ventrículos cerebrales. Además, los efectos de la edad y agentes farmacológicos tales como alcohol y cilostazol en la modificación de los tipos de células ependimarias o sus localizaciones se pueden demostrar, que no era posible antes de esta clasificación de células ependimarias. Cilostazol es un inhibidor de la fosfodiesterasa-3, una enzima que metaboliza cAMP a AMP y también regula el calcio intracelular 9. Utilizando el análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad permite obtener imágenes y cuantificación de la intracelular únicopropiedades de oscilación de calcio de las células ependimarias. Por ejemplo, tanto el alcohol y el cilostazol alteraron significativamente la frecuencia de golpeo ciliar ependimarias, así como las oscilaciones de calcio intracelulares propiedades, que a su vez, podría conducir a un cambio en la reposición de volumen de líquido cefalorraquídeo por cilios ependymal 10. En resumen, esta técnica fue clave para proporcionar la primera evidencia de tres tipos distintos de células ependimarias con diferentes propiedades de oscilación de calcio.
En la siguiente sección, se proporciona una visión detallada paso a paso del procedimiento, prestando especial atención a la preparación y manipulación de tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describe aquí es un protocolo para la preparación de tejido cerebral de ratón tanto para formación de imágenes en vivo y microscopía de fluorescencia que proporciona una rápida y sensible estrecha observación de los cilios ependymal dentro de los ventrículos cerebrales. Esta técnica no se limita a sólo el ventrículo lateral; que podría ser utilizado para observar los cilios en otros ventrículos cerebrales. Esta técnica de imagen proporciona una transmisión en vivo que se asemeja el movimiento del LCR por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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