고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Multiciliated 뇌실막 세포는 성인의 뇌에 심실 라인. 이상 기능이나 뇌실막 섬모의 구조는 다양한 신경 학적 결손과 관련이있다. 운동성 섬모 뇌실막 기술의 생체 라이브 영상 전류는 여러 단계를 다음과 섬모의 역학에 대한 자세한 연구를 위해 수 있습니다. 이 단계는 다음과 같습니다 마우스 이산화탄소와 안락사를 톨레도의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 프로토콜에 따라; vibratome 또는 날카로운 블레이드와 뇌 제거 및 시상 뇌 해부 다음에 두개 절제술은 뇌실막 섬모가 가시화 될 수있는 뇌 측면 심실을 통해 매우 얇은 섹션을 얻었다. 95 % / 5 % O의 존재하에 2 / CO 2 혼합물을 37 ℃에서 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) / 하이 글루코스를 함유하는 맞춤형 유리 - 바닥 접시 뇌 슬라이스 포란 살아있는 조직을 유지하는 것이 필수적이다 시실험. 섬모 고해 비디오이어서 고해상도 미분 간섭 현미경을 이용하여 기록된다. 비디오는 섬모 비팅 주파수를 계산하는 프레임 단위로 분석한다. 이것은 그들의 섬모 박동 주파수와 각도에 따라 세 종류 또는 유형에 뇌실막 세포의 뚜렷한 구분을 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 뇌실막 세포 특유의 세포 내 칼슘 발진 특성뿐만 아니라, 칼슘 진동에 약리학 적 제제의 효과 및 모양체 비팅 주파수의 특성을 고속 형광 영상 분석의 사용을 허용한다. 또한,이 기술은 섬모 구조 및 섬모 단백질 지역화 연구 면역 촬상에 적합하다. 이는 질병 진단 및 표현형 연구에서 특히 중요하다. 뇌 조직이 죽는 시작으로 기술의 주요 제한은 라이브 운동성 섬모 운동의 감소에 기인한다.
서론
섬모 세포 외 환경으로 세포 표면으로부터 연장 감각 미세 소관 기반 소기관이다. "9 + 0"또는 "9 + 2"- 미세 소관들은 조직에 따라 섬모는 두 가지 유형으로 분류 될 수있다. 기능적으로, 그들의 운동에 기초하여, 이러한 운동성 또는 비 - 운동성 섬모 1로 분류 될 수있다. 차 섬모는 일반적으로 "9 + 0"비 운동성 섬모를 나타 내기 위해 사용되는 용어입니다. 이들은 ( '9'로 표시) 아홉 평행 겹 미세 소관 있고 미세 소관의 중앙 쌍 ( '0'로 표시) 내에서 중앙 피복 부재. 그러나, 배아 편측성 규제 등 절점 섬모 일부 "9 + 0"섬모는 2 운동성이다. 한편, 운동성 섬모는 미세 소관 이중선의 추가적인 중앙 쌍, 아홉 병렬 미세 소관 이중선에 더하여, 특징 및 운동성을 촉진하기 네인 모터 단백질과 연관된. 또한, 일부 "9이러한 후각 섬모 등이 "섬모 3 비 운동성이 있습니다. 뇌 심실 및 척수의 중심 관을 긋고 뇌실막 세포는 뇌 심실 4 따라 뇌척수액 (CSF)를 추진 운동성 섬모 특징으로한다.
이 방법의 전반적인 목표는 섬모 역학과 구조적 이상 운동성 연구를 촉진하는 것입니다. 뇌의 건강과 발전은 크게 뇌의 뇌....
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프로토콜
동물 사용에 대한 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 관리 및 사용을위한 설명서에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 실험 동물의.
1. 뇌 추출, 단면 및 조직 준비
- 깊이 5 분 동안 CO 2 질식으로 안락사에 의해 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 희생. 자궁 전위에 의해 죽음을 확신합니다.
- 70 % 에탄올로 마우스 헤드를 청소합니다.
- 제 두개골을 노출시키기 위해 머리 위쪽부터 떨어져 피부를 당겨 멸균 가위 집게를 사용하여 두개 절제술을 수행한다.
- 그런 다음, 두개골이 노출 될 때, 뼈 조각별로 조각을 벗겨 후방 측에서 시작하여 전방쪽으로 이동하여 두개골을 제거합니다. 뇌 심실을 파괴하지 않도록주의해야합니다.
- 전체 뇌를 수집합니다.
- 페니실린 10000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 및 예열 10,000 ㎍ / ml를 함유 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액을 함유 100mm 배양 접시에서 뇌를....
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결과
라이브 마우스의 뇌에 뇌실막 섬모 기능을 측정
이 프로토콜에 기재된 방법은 마우스 뇌뿐만 아니라 모니터링 섬모 비팅 주파수 공부 해부 신선한 조직 뇌실막 섬모 기능과 구조를 모니터링하는 데 사용된다. 전체 실험을 수행하기 위해 그 다음 단계는 개략 플로우 차트 (도 1)에 도시된다. 이것은 고도로 실험 가능한 활성 운동성 섬모를 유지하기 위해 짧은 시간 내에 수행하는 것이 좋다. 대표 시간 경과 영화와 뇌실막 세포와 그들의 운동성 섬모의 이미지도 표시됩니다 (동영상 1 와 그림 2a). 얻어진 스트림 데이터 분석 이동 섬모의 박동 패턴과 각도를 계산함으로써 달성된다. 세 가지 유형으로 섬모를 나누는 기준은 뇌실막 섬모의 존재는 눌러 확인은 표 1에 나타내었다핵 보여 섬모 마커, 아세틸 - - 튜 불린과 rmed하고, 뇌실막 세포 DAPI.......
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토론
실시간 이미징과 뇌 심실 내에 뇌실막 섬모의 신속하고 민감하게 관찰을 제공 형광 현미경 모두 마우스 뇌 조직의 준비를위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 이 기술은 뇌실에 한정되지 않는다; 그것은 다른 뇌 심실에서 섬모를 관찰하는 데에 이용 될 수있다. 이 영상 기술은 생체 외 환경에서 섬모의 박동에 의해 뇌척수액의 움직임과 유사한 라이브 스트림을 제공한다. 또한, 섬모의 운동 방향의 분석을 가능하게한다. 이것은 주로 고해상도 DIC와 형광 이미징 시스템의 사용에 의해 용이하게된다. 이 시스템의 장점은, 현미경이 온도, 습도 및 CO 2 수준의 미세 조절을 허용 환경 챔버로 묶여 있다는 점이다. 이것은 라이브 영상 EXPER을 수행 할 때 조직과 세포의 생존을 위해 고려되어야 매우 중요한 파라미터는iments. 시스템은 또한 섬모 운동 동적 세포 행동의 영상을 용이하게하는 중요한 특징이다 모두 자동 XY 및 Z 모듈뿐만 아니라, 디지털 카메라 및 파장 필터 스위처 장착된다. 현미경은 컴퓨터에 연.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 편집 서비스에 대해 Charisse Montgomery에게 감사의 뜻을 표합니다. A. Alomran의 연구는 약리학 석사 학위 요건을 부분적으로 충족합니다.이 연구는 W.A.A를 위한 University of Toledo의 교내 창업 기금과 S.M.N.을 위한 NIH 보조금(DK080640)의 지원을 받습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM/고혈당 | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| 태아 소 세럼 (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 인산염 완충 식염수 | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15710-SP | |
| 설탕 | 시그마-알드리치 | S-2395 | |
| 트리톤-X | 시그마-알드리치 | T9284 | |
| 플루오-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD 하드셋 마운팅 매체 with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | 클론 6-11B1 |
| FITC 안티 마우스 항체 | Vector Labs | FI-2000 | |
| 세포 배양 플레이트 | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | 니콘 | 니콘 TE2000 | 60X 오일 |
| 현미경 커버 유리 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI 필터 큐브 | 크로마 기술이 |
참고문헌
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia....
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재인쇄 및 허가
