Live-Imaging av Ependymal Cilia i sideventriklene av Mouse Brain

Summary

Ved hjelp av høyoppløselige kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikroskopi, er en ex vivo observasjon av juling av motile ependymal flimmerhårene ligger innenfor muse hjernen ventriklene demonstrert av levende-avbildning. Teknikken gjør et opptak av den unike stråle juling frekvens og slo vinkel samt deres intracellulær kalsium pendling pace egenskaper.

Abstract

Multiciliated ependymal celler linje ventriklene i den voksne hjernen. Unormal funksjon eller struktur av ependymal flimmerhårene er assosiert med ulike nevrologiske utfall. Den nåværende ex vivo levende avbildning av motile ependymal flimmerhårene teknikk muliggjør en detaljert studie av ciliary dynamikk følge flere trinn. Disse trinnene er: mus dødshjelp med karbondioksid i henhold til protokoller fra The University of Toledo Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC); craniectomy fulgt av hjernen fjerning og sagittal hjernen disseksjon med en vibratome eller skarp kniv for å få svært tynne snitt gjennom hjerne sideventriklene, der ependymal flimmerhårene kan visualiseres. Inkubasjon av hjernens skivene i en tilpasset glass-bunnplate inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) / høy-glukose ved 37 ° C i nærvær av 95% / 5% O ₂ / CO _2-blanding er viktig for å holde vevet i live underforsøket. En video av flimmerhårene juling blir deretter tatt opp med en høy oppløsning kontrast differensial forstyrrelser mikroskop. Video blir deretter analysert ramme for ramme til å beregne Ciliary vibrerende frekvens. Dette gjør tydelig klassifisering av ependymal celler i tre kategorier eller typer basert på deres ciliær juling frekvens og vinkel. Videre gir denne teknikken bruk av high-speed fluorescens bildebehandling analyse for å karakterisere den unike intracellulære kalsium vibrasjons- egenskapene ependymal celler samt effekten av farmakologiske midler på kalsium svingninger og ciliary juling frekvens. Dessuten er denne teknikken er egnet for avbildning immunofluorescens for ciliær struktur og ciliare protein lokaliseringsstudier. Dette er spesielt viktig i sykdomsdiagnose og fenotype studier. Den største begrensningen av teknikken er knyttet til reduksjon i levende bevegelige flimmerhårene bevegelse som hjernevevet begynner å dø.

Introduction

Cilia er sensoriske mikrotubul-baserte organeller som strekker seg fra celleoverflaten til det ekstracellulære miljø. Avhengig av mikrotubulus organisasjon kan være cilia kategoriseres i to typer – "9 + 0" og "9 + 2". Funksjonelt, basert på deres motilitet, disse kan bli klassifisert som bevegelig eller ikke-motile cilia ^1. Primær cilia er et begrep som vanligvis brukes for å betegne "9 + 0« ikke-motile cilia. Disse har ni parallelle doublet mikrotubuli (angitt ved "9"), og et sentralt par av mikrotubuli er fraværende innenfor den sentrale skjede (betegnet med "0"). Imidlertid, noen "9 + 0" cilia, slik som nodal cilia, som regulerer embryo laterality er motile ^2. På den annen side er motile cilia karakterisert, i tillegg til de ni parallelle mikrotubul dubletter, ved en ytterligere sentral par mikrotubul dubletter og forbundet med dynein motor proteiner for å lette motilitet. I tillegg har noen "92 "flimmerhårene som olfactory flimmerhårene er ubevegelige ^tre. Ependymal celler lining hjernen ventriklene og sentralkanalen i ryggmargen er preget av motile flimmerhårene som drive cerebrospinalvæsken (CSF) sammen hjernen ventriklene ^4.

Det overordnede målet med denne metoden er å legge til rette for å studere motile cilia dynamikk og strukturelle abnormiteter. Hjernens helse og utvikling sterkt avhengig av effektiv sirkulasjon av CSF i hjernen ventriklene. For eksempel, normal CSF strømning og væskebalanse krever normal vibrerende og funksjonell ependymal cilia ^5,6, som i sin tur spiller avgjørende roller i regulering av retningsbevegelse av nerveceller og stamcelle migrasjon ^7. Som sådan unormal ependymal cilia funksjon eller struktur som kan føre til unormal CSF strømning, som er forbundet med vann, en medisinsk tilstand hvor det er en unormal oppsamling av CSF i ventriklene i bregn. Dette kan dermed føre til økt intrakranielt trykk og progressiv utvidelse av hodet, kramper, tunnelsyn, og psykisk funksjonshemming ^8.

Fordelene ved denne teknikk i forhold til eksisterende metoder er at det er mulig for første gang å rapportere tre distinkte ependymal celletyper: I, II, og III, på grunnlag av deres unike ciliær vibrerende frekvens og slå vinkel. Disse ependymal cellene er lokalisert innenfor visse områder i hjernen ventriklene. Videre kan effektene av alder og farmakologiske midler slik som alkohol og cilostazol på å endre ependymal celletyper eller deres lokaliseringer påvises, noe som ikke var mulig før denne klassifiseringen av ependymal celler. Cilostazol er en hemmer av fosfodiesterase-3, et enzym som metaboliserer cAMP til AMP og det også regulerer intracellulær kalsium ^9. Ved hjelp av høyhastighets fluorescens bildebehandling analyse tillater avbildning og kvantifisering av den unike intracellulærekalsium vibrasjons- egenskapene til ependymal celler. For eksempel, både alkohol og cilostazol vesentlig endret ependymal stråle vibrerende frekvens, så vel som de intracellulære kalsium Svingninger egenskaper, noe som i sin tur kan føre til en endring i cerebrospinalvæsken volumet erstattet med ependymal cilia ^10. I sammendraget, denne teknikken var nøkkelen til å gi det første bevis på tre forskjellige typer ependymal celler med ulike kalsium vibrasjons- egenskaper.

I neste avsnitt, er en detaljert steg-for-steg oversikt over prosedyren gitt, vier oppmerksomhet til vev forberedelse og håndtering.

Protocol

Prosedyrene for bruk av dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra The University of Toledo i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk komité ved National Institutes of Health og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. 1. Brain Utvinning, Seksjonering og Vevspreparering Ofre villtype mus belastning C57BL / 6 ved dypt euthanizing med CO 2 kvelning i 5 min. Forsikre døden ved halshugging. Rengjør museho…

Representative Results

Måling ependymal flimmerhårene funksjon i levende mus hjernen Metoden som beskrives i denne protokollen blir brukt for å overvåke ependymal cilia funksjon og struktur i den friske vev dissekert fra musehjerne, så vel som til å overvåke og studere cilia vibrerende frekvens. Trinnene følges for å oppnå en fullstendig eksperiment er vist i et skjematisk flytdiagram (figur 1). Det anbefales sterkt at forsøket er gjennomført innenfor en kort tidsramme for å holde bev…

Discussion

Beskrevet her er en protokoll for fremstilling av muse-hjernevev for både live-avbildning og fluorescensmikroskopi som gir en hurtig og følsom nøye observasjon av ependymal cilia i hjernen ventriklene. Denne teknikken er ikke begrenset til den laterale ventrikkel bare; Det kan benyttes for å observere cilia i andre hjerne ventriklene. Dette avbildningsteknikk gir en live stream som ligner bevegelsen av CSF ved stråle juling i en ex vivo setting. Videre, det gir analyse av retningsbestemt bevegelse av cilia…

Materials

DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18×18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology