Summary

Simultaan<em> Ex vivo</em> Functioneel testen van Two netvliezen door<em> In vivo</em> Elektroretinogram System

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

Elektroretinogram (ERG) is een gevestigde techniek die kan worden gebruikt om de elektrische activiteit van het netvlies veroorzaakt door licht te nemen. De ERG signaal ontstaat vooral bij spanningsveranderingen veroorzaakt door radiale stroming (langs de as van fotoreceptoren en bipolaire cellen) stroomt in de resistieve extracellulaire ruimte van de retina. De eerste ERG signaal werd in 1865 opgenomen door Holmgren van het oppervlak van een fish eye 1. Einthoven Jolly 1908 en 2 verdeelden de ERG reactie op het ontstaan ​​van licht in drie verschillende golven, a- genoemd, b- en c-golven, die nu bekend zijn voornamelijk de activiteit van fotoreceptoren geven, ON bipolaire cellen en pigmentepitheel cellen, respectievelijk 3-8. ERG kunnen worden opgenomen van de ogen van verdoofde dieren of mensen (in vivo), van geïsoleerde oogwater 9, over geïsoleerde intacte retina (ex vivo) 3,10-15 of over specifieke retina lagen met micro-elektroden (plaatselijkeERG) 4,16. Daarvan in vivo ERG is momenteel de meest gebruikte methode om retinale functie bepalen. Het is een niet-invasieve techniek die kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden of voor de progressie van retinale ziekten bij dieren of patiënten te volgen. In vivo ERG opnames produceren complexe signaal met meer overlappende componenten, vaak besmet met oculaire fysiologische ruis (bijvoorbeeld ademhaling en hartactiviteit).

Plaatselijke ERG kan worden gebruikt om het signaal over specifieke lagen van het netvlies te nemen, maar het is het meest ingrijpende en heeft de laagste signaal-ruisverhouding (SNR) in vergelijking met de andere ERG opname configuraties. Lokale ERG is ook technisch veeleisend en vereist dure apparatuur (bijvoorbeeld, microscoop en micromanipulators). Transretinal ERG van de intacte, geïsoleerde netvlies (ex vivo ERG) biedt een compromis tussen in vivo en lokale ERG methodes waardoor stabiele en high SNR opnames uit intacte netvliezen van dieren of mensen 17. Recent is deze werkwijze met succes gebruikt om staafjes en kegeltjes fotoreceptor functie bij zoogdieren, primaten en menselijke retina 18-20 bestuderen. Bovendien door het ontbreken van pigment epitheel bij de ex vivo netvlies, de positieve c-golfcomponent van de ERG signaal is verwijderd en een prominente negatieve langzame PIII component wordt geopenbaard in het ex vivo opnames. De trage PIII component is aangetoond afkomstig uit de activiteiten van Müller glia cellen in de retina 21-23. Aldus kan ex vivo ERG methode ook worden gebruikt om Müller cellen te bestuderen in het intacte retina. Verscheidene studies hebben ook aangetoond dat ex vivo ERG opnames kunnen worden gebruikt om de concentratie van farmacologische middelen meten rond de retina 24 en test de veiligheid en de werkzaamheid van geneesmiddelen 25-27.

Meerdere commerciële in vivo systemen zijn beschikbaar enin vele laboratoria, die niet noodzakelijkerwijs uitgebreide elektrofysiologie achtergrond. Daarentegen zijn ex vivo apparaten beschikbaar tot voor kort 17 en daardoor slechts zeer weinig laboratoria momenteel maken van deze krachtige techniek. Het zou gunstig zijn voor ex vivo ERG opnamen beschikbaar om meer laboratoria maken om onze kennis over het netvlies fysiologie en pathologie te bevorderen, en om nieuwe therapieën te ontwikkelen voor verblindende ziekten. We tonen hier een eenvoudige en betaalbare ex vivo ERG apparaat 17 en hoe het kan worden gebruikt in combinatie met diverse commercieel verkrijgbaar in vivo ERG systemen staaf- en-cone-gemedieerde signalering opnemen (a- en b-golven) en de functie van Müller cellen (langzaam PIII) uit intacte wild-type muis netvliezen.

Protocol

Alle experimentele protocollen waren in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de institutionele commissie Animal Studies aan de Universiteit van Washington. 1. Opstellen perfusie en Specimen Holder Bereid oplossing retina perfusie verse op de dag van het experiment. Gebruik gedestilleerd en gedemineraliseerd water. Gebruik een van de volgende drie oplossingen. Bereid bicarbonaat bevattende Ames 'oplossing (1 L):…

Representative Results

We namen flash antwoorden van donker aangepaste wild-type (WT) C57BL / 6 muis netvliezen door de testprotocollen hierboven beschreven en in figuur 1 met verschillende standaard perfusie-oplossingen (figuur 2). De respons curven en kinetiek betreffende de gevoeligheid van staaf fotoreceptoren, vergelijkbaar in Ames en Locke's media (figuur 2A en B). Anderzijds, onder HEPES-gebufferde Ringer-oplossing (zonder bicarbonaat of 5% CO2 / 95% <su…

Discussion

We tonen hier de kritische stappen voor het verkrijgen van hoge kwaliteit ex vivo ERG opnames tegelijkertijd van twee geïsoleerde muis netvliezen met behulp van in vivo ERG systeemcomponenten samen met een ex vivo ERG adapter. In deze studie perfusie we zowel netvliezen van het dier met dezelfde oplossing (ofwel Ames, Locke's of Ringer), maar het is ook mogelijk om elke retina perfuseren met een andere oplossing bijvoorbeeld voor dopingcontroledoeleinden. De belangrijkste s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies EY019312 en EY021126 (VJK), EY002687 aan de afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences aan de Universiteit van Washington, en door onderzoek ter voorkoming van Blindheid.

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

References

  1. Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Play Video

Cite This Article
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

View Video