Summary

Simultané<em> Ex vivo</em> Tests fonctionnels de deux rétines par<em> In vivo</em> Système Électrorétinogramme

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

Électrorétinogramme (ERG) est une technique bien établie qui peut être utilisé pour enregistrer l'activité électrique de la rétine provoquée par la lumière. Le signal est généré ERG principalement par les variations de tension provoquées par les courants radiaux (selon l'axe des photorécepteurs et les cellules bipolaires) circulant dans l'espace extracellulaire résistif de la rétine. Le premier signal ERG a été enregistrée en 1865 par Holmgren de la surface d'un œil de poisson 1. Einthoven et Jolly 1908 2 divisés la réponse ERG à l'apparition de la lumière en trois vagues différentes, appelé A, B, et C-ondes, qui sont maintenant connu pour refléter principalement l'activité des photorécepteurs, les cellules bipolaires ON, et l'épithélium pigmentaire cellules, respectivement 8.3. ERG peut être enregistrée dans les yeux des animaux anesthésiés ou humains (in vivo), de la préparation des yeux isolé 9, à travers la rétine isolée intacte (ex vivo) 3,10-15 ou à travers les couches de la rétine spécifiques avec des microélectrodes (localERG) 4,16. Parmi ceux-ci, in vivo ERG est actuellement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la fonction rétinienne. Il est une technique non invasive qui peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour suivre la progression de maladies de la rétine chez les animaux ou patients. Cependant, in vivo enregistrements ERG produisent un signal compliqué avec plusieurs composants qui se chevauchent, souvent contaminés par le bruit extraoculaire physiologique (par exemple, la respiration et l'activité cardiaque).

ERG local peut être utilisé pour enregistrer le signal à travers des couches spécifiques de la rétine, mais il est le plus invasive et présente le plus faible rapport signal-sur-bruit (SNR) par rapport aux autres configurations d'enregistrement ERG. ERG local est aussi techniquement exigeante et nécessite un équipement coûteux (par exemple, un microscope et micromanipulateurs). Transretinal ERG de la intacte, la rétine isolée (ex vivo ERG) offre un compromis entre les méthodes in vivo et ERG locales permettant stable et higenregistrements h SNR de rétines intactes d'animaux ou les humains 17. Récemment, cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la fonction des bâtonnets et des cônes photorécepteurs dans les rétines de mammifères, les primates et les droits de 18-20. En outre, en raison de l'absence de l'épithélium pigmentaire de la rétine ex vivo, la composante c-onde positive du signal ERG est retiré et un composant PIII lente négative importante est révélée dans les enregistrements ex vivo. La composante lente PIII a été démontré que provenir de l'activité des cellules gliales de Müller dans la rétine 21-23. Ainsi, ex vivo ERG procédé pourrait également être utilisé pour étudier les cellules de Müller dans la rétine intacte. Plusieurs études ont également montré que les ex vivo enregistrements ERG pourraient être utilisés pour mesurer la concentration d'agents pharmacologiques autour de la rétine 24 et de tester l'innocuité et l'efficacité des médicaments 25-27.

Multiple commercial dans des systèmes in vivo sont disponibles etutilisée dans de nombreux laboratoires qui ne disposent pas nécessairement vaste expérience en électrophysiologie. En revanche, ex vivo dispositifs ont pas été disponible jusqu'à récemment 17 et par conséquent que très peu de laboratoires sont en cours avantage de cette technique puissante. Il serait bénéfique de faire des enregistrements ex vivo ERG disponible pour plusieurs laboratoires afin de faire progresser nos connaissances sur la physiologie et la pathologie de la rétine, et de développer de nouvelles thérapies pour les maladies cécitantes. Nous démontrons ici un dispositif simple et abordable ex vivo ERG 17 et montrons comment il peut être utilisé en combinaison avec plusieurs systèmes vivo ERG disponibles dans le commerce pour enregistrer dans la signalisation de bâtonnet et le cône médiation (A et B-ondes) et la fonction de les cellules de Müller (ralentir PIII) de rétines de souris de type sauvage intacte.

Protocol

Tous les protocoles expérimentaux étaient en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel Animal Studies à l'Université de Washington. 1. Configuration de perfusion et porte-échantillon Préparer la solution pour perfusion rétine frais sur le jour de l'expérience. Utilisez de l'eau distillée et déminéralisée. Utilisez l'une des trois solutions suivantes. <…

Representative Results

Nous avons enregistré les réponses flash de type sauvage adaptés à l'obscurité (WT) C57BL / 6 rétines de souris en suivant les protocoles expérimentaux décrits ci-dessus et illustrés dans la Figure 1 en utilisant différentes solutions de perfusion classiques (Figure 2). Les formes d'ondes et de la cinétique de réponse ainsi que la sensibilité des photorécepteurs à bâtonnets semblent similaires à Ames »et les médias de Locke (Figure 2A et <stro…

Discussion

Nous démontrons ici les étapes critiques pour l'obtention de haute qualité ex vivo enregistrements ERG simultanément à partir de deux rétines de souris isolées en utilisant des composants in vivo du système ERG avec un ex vivo ERG adaptateur. Dans cette étude, nous avons perfusé les deux rétines de l'animal avec la même solution (soit Ames ', Ringer Locke ou) mais il est également possible de perfuser chaque rétine avec une solution différente, par exemple,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NIH subventions EY019312 et EY021126 (VJK), EY002687 au Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles à l'Université de Washington, et par la recherche pour prévenir la cécité.

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

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Cite This Article
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

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