Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

A gravidez é caracterizada pela infiltração de leucócitos nos tecidos reprodutivos e na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal). Essa interface é o sítio anatômico de contato entre mãe e tecidos fetais; por conseguinte, é um local de acção imunológica durante a gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal de desempenhar um papel central na implantação, manutenção da gravidez, e tempo de entrega. Portanto, caracterizações fenotípicas e funcionais desses leucócitos irá fornecer insights sobre os mecanismos que levam a distúrbios de gravidez. Vários protocolos têm sido descritos, a fim de isolar a partir de leucócitos de infiltração a decídua basal e parietal decidua; no entanto, a falta de coerência nos reagentes, enzimas, e os tempos de incubação torna difícil comparar estes resultados. Descreve-se aqui uma nova abordagem que combina a utilização de Diss mecânicas e enzimáticas suavesociation técnicas para preservar a viabilidade e a integridade dos marcadores extracelulares e intracelulares em leucócitos isolados a partir dos tecidos humanos na interface materno-fetal. Além de imunofenotipagem, cultura de células, e separação de células, as futuras aplicações deste protocolo são numerosos e variados. Seguindo este protocolo, os leucócitos isolados podem ser usados ​​para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro de leucócitos (isto é, a fagocitose, a citotoxicidade, proliferação de células T, e plasticidade, etc), e a produção de espécies reactivas de oxigénio na interface materno-fetal. Além disso, utilizando o protocolo descrito, este laboratório tem sido capaz de descrever novos e raros leucócitos na interface materno-fetal.

Introduction

A gravidez é caracterizada por três fases distintas: 1 imunológicos) implantação e placentação precoce associada com uma resposta pro-inflamatória (isto é, o implante se assemelha a um "ferida aberta"); 2) o segundo trimestre da gravidez, a maior parte do terceiro trimestre de gravidez quando homeostase imune é alcançada através de um estado predominantemente anti-inflamatório na interface materno-fetal; e 3) o parto, um estado pró-inflamatório ^1-7. Células do sistema imunológico desempenha um papel importante na regulação da resposta inflamatória na interface materno-fetal, onde sua abundância e mudança de localização durante toda a gravidez ^6-9.

Nos seres humanos, a interface materno-fetal representa uma área de contacto directo entre materna (decídua) e fetal (cório ou trofoblasto) tecidos. Esta interface inclui: 1) a decídua parietal que reveste a cavidade uterina não coberta pela placenta e está em justaposiçãopara o córion liso; e 2) os decídua basal, localizados na placa basal da placenta, onde é invadido por trofoblastos intersticiais ¹⁰ (Figura 1). A intimidade dessas áreas de contato cria condições para a exposição antigênica fetal à ^11-13 sistema imunológico materno. Não surpreendentemente, leucócitos compreender até 30-40% das células deciduais ^8,9,14,15 além de células do tipo do estroma e as células glandulares típicos ^8,14,16. O papel dos leucócitos na interface materno-fetal engloba vários processos que incluem a limitação da invasão do trofoblasto ^17, remodelação das artérias em espiral ^18,19, manutenção da tolerância materna ^12,20, eo início do trabalho de parto ^21-26. Leucócitos de ambos os membros adaptativa e inata do sistema imune, isto é, células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, células NK, e foram identificados em tecidos deciduais, e suasproporções e estado de activação ter sido demonstrado que variam espacialmente e temporalmente ao longo da gestação ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbações na população e / ou função de leucócitos estão associados com aborto espontâneo ^31, pré-eclâmpsia ^32, restrição de crescimento intrauterino ^32,33, e trabalho de parto prematuro ^7,24. Por conseguinte, o estudo das suas características fenotípicas e funcionalidade de leucócitos na interface materno-fetal humano facilitará a elucidação das vias desreguladas em perturbações imunológicas gravidez.

Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para determinar o fenótipo e as propriedades funcionais de leucócitos é a citometria de fluxo, a tecnologia que permite a análise quantitativa de vários parâmetros simultaneamente ^34-36. Para análise de leucócitos por citometria de fluxo, é necessário o isolamento de leucócitos de uma suspensão de célula única. Por conseguinte, um método para separar Leu infiltrantekocytes a partir da interface materno-fetal é necessária para estudar a sua fenotípica e propriedades funcionais.

Vários métodos têm sido descritos para isolar leucócitos a partir da interface materno-fetal humano ^{10,14,25,27,37-39.} Enquanto alguns se aplicam desagregação mecânica ^10,25,27,38, outros usam digestão enzimática ^37,40 para a dissociação do tecido. Porque desagregação mecânica produz um rendimento mais baixo e reduziu a viabilidade ^41, e dissociação enzimática pode afectar a viabilidade celular e a superfície de retenção do marcador ^42, o método aqui descrito combina a dissociação mecânica suave com pré-tratamento enzimático para aumentar o rendimento de leucócitos isolados, sem comprometer a viabilidade celular. Uma combinação similar de métodos tem sido demonstrado ser eficaz no isolamento de leucócitos a partir de tecidos deciduais na interface materno-fetal ^39. Portanto, o protocolo aqui descrito envolve a mechadesagregação nica com um Dissociator tecido automático que aumenta a consistência, poupando tempo e trabalho quando comparado ao picar tradicional com bisturis, lâminas de barbear opostas, ou tesoura cirúrgica ^10,28. O enzima escolhido para a dissociação de tecidos foi Accutase. Ao contrário de colagenase comumente usados ^​​43, Dispase ^44, e tripsina ^45, Accutase (uma solução de desprendimento de células) combina proteolítica geral e as actividades que contribuem para colagenolíticas eficiente dissociação ainda suave ^46,47. Depois de dissociação, os leucócitos são enriquecidos da população total das células deciduais por centrifugação em gradiente de densidade. Vários meios de gradiente de densidade foram anteriormente utilizados, o mais comum dos quais são de Percoll (uma suspensão de partículas de sílica coloidal) e Ficoll a ⁴⁸ (um polímero de sacarose com um peso molecular elevado sintético) ^49. A maior eficácia de isolamento por o polímero de sacarose foi previously mostrado ^50, e o protocolo descrito aqui ainda prova que esta mídia gradiente de densidade produz uma pureza suficientemente elevada de leucócitos mononucleares.

Assim, o protocolo aqui descrito combina a desagregação mecânica do tecido com um tecido Dissociator automática, a digestão enzimática com uma solução de separação celular, e separação de leucócitos com um meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para isolar leucócitos de tecidos deciduais humanas. Este protocolo foi comprovada para preservar os antigénios da superfície das células, juntamente com a viabilidade celular. Os leucócitos isolados podem ser usados ​​em várias aplicações que incluem a imunofenotipagem com a citometria de fluxo e estudos funcionais in vitro.

Protocol

Este protocolo é apropriado para o isolamento de leucócitos dos decídua basal e parietalis decídua em preparação para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Além disso, as células isoladas podem ser utilizadas para selecção de células, cultura de células, o isolamento de RNA, e citologia. Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética humana deve ser obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa local e Conselhos de Revisão Institucional. A recolha e utilização…

Representative Results

. A dissecção de tecidos humanos na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal) é mostrado na Figura 1 Este procedimento inclui a dissecção da placa basal, que inclui os decídua basal (Figura 1A – D). A decídua basal é obtido pela remoção da vilosidade placentário (lado fetal) a partir da placa basal (Figura 1C). A parietal decidua é recolhido por raspagem suave da membrana coriónica (Figura 1E – F)…

Discussion

Caracterização das propriedades funcionais e fenotípicas de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humana é essencial para a compreensão dos mecanismos imunes que levam a desordens gravidez. Diversas técnicas têm sido descritas, a fim de isolar leucócitos da interface materno-fetal humano durante a gravidez ^{10,14,25,28,37,42,43.} No entanto, cada uma destas técnicas é distinto, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não esp…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator