İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu
Summary
Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Abstract
Gebelik yeniden üretici dokularda ve maternal-fetal arayüzünde lökositlerin (Desidua basalis ve Desidua parietalis) infiltrasyonu ile karakterize edilir. Bu arayüz maternal ve fetal dokular arasındaki temas anatomik sitedir; bu nedenle, gebelik sırasında eylem bir immünolojik sitedir. Maternal-fetal arayüzünde infiltre lökositler teslimat merkezi implantasyon rol, gebelik bakımı ve zamanlama oynarlar. Bu nedenle, bu lökositlerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep mekanizmalarına fikir verecektir. Birçok protokol Desidua basalis ve Desidua parietalis gelen lökositlerin infiltre izole etmek için de tarif edilmiştir; bununla birlikte inkübasyon, reaktifler, enzimler ve belirli bir süre içinde düzenli olmaması zor bu sonuçları karşılaştırma yapar. Burada tarif edilen yumuşak mekanik ve enzimatik diss kullanımını birleştiren yeni bir yaklaşımdırociation teknikleri maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilen lökosit hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin canlılığı ve bütünlüğünü korumak için. Kenara immünofenotiplendirme, hücre kültürü ve hücre sıralama gelen, bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok sayıda ve çeşitlidir. Bu protokol, izole edilmiş DNA, lökosit nitro lökosit işlev (yani, fagositoz, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastiklik, vs.) metilasyonu, hedef genlerin ekspresyonunu, ve reaktif oksijen türlerinin üretimini belirlemek için kullanılabilir maternal-fetal arayüzünde. Ayrıca, açıklanan protokolünü kullanarak, bu laboratuar maternal-fetal arayüzünde yeni ve nadir lökosit tanımlamak mümkün olmuştur.
Introduction
Gebelik üç ayrı aşamadan immünolojik ile karakterize edilir: 1) implantasyon ve pro-enflamatuar yanıt ile ilişkili erken plasenta (yani, implantasyon, bir 'açık yara' benzeyen); 2) ikinci trimester ve bağışıklık homeostazı maternal-fetal arayüzünde ağırlıklı anti-inflamatuar devlet yoluyla elde edilir gebeliğin üçüncü trimesterde en; ve 3) doğum, bir pro-inflamatuar durum 1-7. Bağışıklık hücreleri maternal-fetal arayüzünde inflamatuar yanıtın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar nerede onların bereket ve gebelik süresince 6-9 yerelleştirme değişim.
İnsanlarda, maternal-fetal arayüz anne (desidua) ve fetal (koryon veya trofoblast) dokular arasındaki doğrudan temas bir alanı temsil eder. 1) desidua hatları uterin kavite plasenta kapsamında değil parietalis ve yan yana olan: Bu arayüz içerirkoryon laeve için; ve 2) interstisyel trofoblastlar 10 (Şekil 1) tarafından işgal plasenta bazal plaka bulunan desidua basalis. temas bu alanların samimiyet maternal bağışıklık sistemi 11-13 fetal antijenik maruz kalma koşulları yaratır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, lökositlerin normal stromal tipi hücreler ve bez hücrelerinde 8,14,16 ilave olarak desidual hücrelerde 8,9,14,15% 30-40 kadar içermektedir. maternal-fetal arayüzünde lökositlerin rolü trofoblast invazyonu 17 sınırlandırılmasına spiral arterlerin 18,19 yenileme, anne hoşgörü 12,20 bakım ve emek 21-26 başlatılmasını dahil çoklu süreçleri kapsar. Uyarlanabilir ve örneğin, T hücreleri, makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, dendritik hücreler ve NK hücreleri, desidual dokularda tespit edilmiştir bağışıklık sistemi, doğuştan gelen uzuvlar, ve bunların her ikisinin de Lökositleroranlar ve aktivasyon durumu gebelik 6-10,12,14,24,27-30 boyunca mekansal ve zamansal olarak değişir gösterilmiştir. Lökosit nüfus ve / veya işlev tedirginlikler spontan abortus 31 preeklampsi 32, intrauterin gelişme geriliği 32,33 ve preterm eylem 7,24 ile ilişkilidir. Bu nedenle, insan maternal-fetal arayüzünde fenotipik özellikleri ve lökositlerin işlevselliği çalışma gebelik bozukluklarında disregüle immünolojik yolların açıklanmasını kolaylaştıracaktır.
Birden parametrelerin eş zamanlı olarak 34-36 kantitatif analiz sağlar akım sitometri olan fenotip ve lökositlerin işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılan en güçlü araçlardan biri, teknoloji. Akış sitometrisi ile lökosit analiz etmek için, tek hücreli bir süspansiyon içinde lökositlerin izolasyonu gereklidir. Bu nedenle, bir yöntem, leu infiltre ayırmakmaternal-fetal arayüzden kocytes kendi fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için gereklidir.
Çeşitli yöntemler, insan maternal-fetal arayüz 10,14,25,27,37-39 gelen lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bazı mekanik ayrıştırılmasına yönelik çabalara 10,25,27,38 geçerli olsa da, diğerleri doku ayrılma için enzimatik sindirimi 37,40 kullanın. Mekanik parçalanma daha düşük bir verim ve düşük canlılığı 41 ve canlılık ve hücre yüzeyi işaretleme tutma 42 etkileyebilir enzimatik dissosiasyonunu için, burada tarif edilen yöntem, hücre canlılığını tehlikeye atmadan izole lökositlerin verimini artırmak için enzimatik ön-muamele ile hafif mekanik bir ayrışma birleştirir. Yöntemlerin de benzer bir kombinasyonu maternal fetal arabirim 39 ile desidual dokulardan lökositlerin izolasyonu ile etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol mekanizmalarını içermektedirkarşıt neşter, tıraş bıçakları, veya cerrahi makas 10,28 geleneksel kıyma haline gelme işleminde göre zaman ve emek tasarrufu sağlarken tutarlılığını artırır otomatik doku dissociator ile nical parçalanma. Doku Ayrılma için seçilen enzim Accutase oldu. Yaygın olarak kullanılan kollajenaz 43 aksine 44 dispase ve tripsin 45 Accutase (hücre dekolmanı çözeltisi) genel proteolitik ve verimli henüz nazik ayrılma 46,47 katkıda kolajenolitik faaliyetleri hem birleştirir. Ayrıştırmadan sonra, lökosit yoğunluk gradyan santrifüjü ile desidual hücrelerin toplam popülasyonundan zenginleştirilmiştir. Çeşitli yoğunluk gradyan Ortam daha önce Percoll (koloidal silis taneciklerinin bir süspansiyon), 48 ve Ficoll (yüksek sentetik bir molekül ağırlığına sahip olan, sukrozun bir polimer) 49 En yaygın olanı, kullanılmıştır. sakaroz polimerin tarafından tecrit üstün verim onceki olmuşturusly 50 gösterilmektedir, ve burada daha fazla tarif protokolü bu yoğunluk gradyan ortam mononükleer lökositlerin yeterince yüksek saflığa ürettiğini kanıtlamaktadır.
Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol, insan desidual dokularından lökosit izole etmek için bir yoğunluk gradyan ortam (1.077 + 0.001 gr / ml) ile otomatik bir doku aynştıncı, bir hücre ayırma çözeltisi ile enzimatik sindirme ve lökosit ayırma mekanik doku parçalanmalanna birleştirir. Bu protokol, hücre canlılığı ile birlikte hücre yüzey antijenlerini korumak için kanıtlanmıştır. İzole lökosit akış sitometrisi ve in vitro fonksiyonel çalışmalar ile immünofenotıpleme birden fazla uygulama için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan maternal-fetal arayüzünde lökositler infiltre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerinin karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep bağışıklık mekanizmalarının anlaşılması için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 10,14,25,28,37,42,43 boyunca insan maternal-fetal arayüzünden lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri farklı olan, her zaman izole edilmiş hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzim veya enzim kombinas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, NIH / DHHS tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatoloji Girişimi tarafından, kısmen, desteklenmiştir. Biz minnetle yazının onun eleştirel okumalar için Maureen McGerty (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.
Materials
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |
References
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition–a review. Placenta. 24, S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, S7 (2007).
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy–a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, ., B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
