L'isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Gravidanza è caratterizzata dalla infiltrazione di leucociti nei tessuti riproduttivi e all'interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis). Questa interfaccia è il sito anatomico di contatto tra materna e tessuti fetali; Pertanto, è un sito immunologica di azione durante la gravidanza. Leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale svolgono un ruolo centrale in impianto, manutenzione di gravidanza, e la tempistica di consegna. Pertanto, caratterizzazioni fenotipiche e funzionali di questi leucociti forniranno informazioni sui meccanismi che portano a disturbi della gravidanza. Diversi protocolli sono stati descritti per isolare leucociti infiltranti dai basalis decidua e parietalis decidua; Tuttavia, la mancanza di uniformità nei reagenti, enzimi, e tempi di incubazione rende difficile confrontare questi risultati. Descritto qui è un nuovo approccio che combina l'uso di dolci diss meccanici ed enzimaticitecniche ociation per preservare la vitalità e l'integrità dei marcatori extracellulari e intracellulari nei leucociti isolati dai tessuti umani all'interfaccia materno-fetale. A parte immunofenotipizzazione, coltura cellulare, e lo smistamento delle cellule, le future applicazioni di questo protocollo sono numerose e varie. Seguendo questo protocollo, i leucociti isolati possono essere utilizzati per determinare la metilazione del DNA, l'espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (cioè, fagocitosi, citotossicità, la proliferazione delle cellule T, e plasticità, ecc), e la produzione di specie reattive dell'ossigeno all'interfaccia materno-fetale. Inoltre, utilizzando il protocollo descritto, questo laboratorio è stato in grado di descrivere nuove e rare leucociti all'interfaccia materno-fetale.

Introduction

La gravidanza è caratterizzato da tre fasi distinte, immunologiche: 1) impianto e placentazione precoce associata ad una risposta pro-infiammatoria (cioè, l'impianto assomiglia un 'ferita aperta'); 2) il secondo trimestre e la maggior parte del terzo trimestre di gravidanza, quando omeostasi immunitaria è ottenuta attraverso uno stato prevalentemente antinfiammatoria all'interfaccia materno-fetale; e 3) il parto, uno stato pro-infiammatorio ^1-7. Le cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella regolazione della risposta infiammatoria all'interfaccia materno-fetale in cui la loro abbondanza e il cambiamento di localizzazione durante la gravidanza ^6-9.

Negli esseri umani, l'interfaccia materno-fetale rappresenta un'area di contatto diretto tra materna (decidua) e fetale (corion o trofoblasto) tessuti. Questa interfaccia comprende: 1) la decidua parietalis che riveste la cavità uterina non coperto dalla placenta ed è in giustapposizioneal laeve corion; e 2) i basale decidua, che si trova nel piatto basale della placenta dove viene invasa da trophoblasts interstiziali ¹⁰ (Figura 1). L'intimità di queste aree di contatto crea le condizioni per l'esposizione fetale antigenica materno ^11-13 sistema immunitario. Non sorprendentemente, leucociti comprendono fino al 30-40% delle cellule deciduali ^8,9,14,15 in aggiunta alle cellule stromali tipici tipo e cellule ghiandolari ^8,14,16. Il ruolo dei leucociti all'interfaccia materno-fetale comprende più processi che includono la limitazione del trofoblasto dell'invasione ^17, rimodellamento delle arterie spirali ^18,19, mantenimento della tolleranza materno ^12,20, e l'avvio del lavoro ^21-26. Leucociti sia del adattativa e arti innate del sistema immunitario, cioè, le cellule T, macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule dendritiche e cellule NK, sono state identificate nei tessuti deciduali, e loroproporzioni e lo stato di attivazione hanno dimostrato di variare spazialmente e temporalmente durante la gestazione ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbazioni nella popolazione e / o la funzione dei leucociti sono associati con aborto spontaneo ^31, preeclampsia ^32, ritardo di crescita intrauterino ^32,33, e parto pretermine ^7,24. Pertanto, lo studio delle caratteristiche fenotipiche e funzionali di leucociti all'interfaccia materno-fetale umano faciliterà la delucidazione delle vie immunologiche disregolato nei disturbi della gravidanza.

Uno degli strumenti più potenti utilizzati per determinare il fenotipo e proprietà funzionali dei leucociti è citometria a flusso, la tecnologia che consente l'analisi quantitativa di più parametri contemporaneamente ^34-36. Per analizzare leucociti mediante citometria di flusso, è richiesto l'isolamento dei leucociti in una cella singola sospensione. Pertanto, un metodo per separare infiltrazione leukocytes dall'interfaccia materno-fetale è necessario per studiare la loro fenotipiche e funzionali.

Diversi metodi sono stati descritti per isolare leucociti dall'interfaccia materno-fetale umano ^{10,14,25,27,37-39.} Mentre alcuni si applicano disaggregazione meccanica ^10,25,27,38, altri usano digestione enzimatica ^37,40 per la dissociazione dei tessuti. Perché disaggregazione meccanica produce una resa inferiore e ridotto la vitalità ^41, e la dissociazione enzimatica può influenzare la vitalità e superficie cellulare marcatore ritenzione ^42, il metodo qui descritto combina dolce dissociazione meccanica con enzimatica pretrattamento per aumentare la resa dei leucociti isolati, senza compromettere la vitalità cellulare. Una simile combinazione di metodi è stato dimostrato per essere efficace nell'isolamento dei leucociti dai tessuti deciduali all'interfaccia materno-fetale ^39. Pertanto, il protocollo qui descritto comporta mechadisaggregazione nica con un dissociatore tessuto automatico che aumenta la coerenza risparmiando tempo e fatica rispetto a macinazione tradizionale con bisturi contrapposti, lame di rasoio o forbici chirurgiche ^10,28. L'enzima scelto per la dissociazione dei tessuti era Accutase. A differenza di uso comune collagenasi ^43, dispasi ^44, e ⁴⁵ tripsina, Accutase (una soluzione distacco cellulare) combina proteolitici generale e le attività che contribuiscono al collagenolitica efficiente dissociazione ma delicato ^46,47. Dopo la dissociazione, i leucociti sono arricchiti dalla popolazione totale delle cellule deciduali di gradiente di densità centrifugazione. Vari mezzi gradiente di densità sono stati precedentemente utilizzati, il più comune dei quali sono Percoll (una sospensione di particelle di silice colloidale) ⁴⁸ e Ficoll (un polimero di saccarosio con un elevato peso molecolare sintetica) ^49. L'efficienza superiore di isolamento dal polimero saccarosio è stata previously mostrato ^50, e il protocollo descritto qui ulteriormente dimostra che questo supporto gradiente di densità produce una sufficientemente elevata purezza dei leucociti mononucleari.

Pertanto, il protocollo qui descritto combina la disaggregazione tessuto meccanico con dissociatore automatica tessuto, la digestione enzimatica con una soluzione distacco cellulare, e la separazione dei leucociti con un supporto gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) per isolare leucociti da tessuti deciduali umani. Questo protocollo è stato dimostrato per preservare antigeni di superficie cellulare con la vitalità cellulare. I leucociti isolati possono essere utilizzati per molteplici applicazioni che includono immunofenotipizzazione con citometria di flusso e studi funzionali in vitro.

Protocol

Questo protocollo è appropriato per leucociti isolamento dai basalis decidua e parietalis decidua in preparazione per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Inoltre, le cellule isolate possono essere utilizzati per la separazione delle cellule, colture cellulari, isolamento dell'RNA, e citologia. Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l'approvazione etica umana deve essere ottenuto dal Research Comitato Etico Locale e Institutional Review Boards. La raccolta e l'utili…

Representative Results

. La dissezione dei tessuti umani all'interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis) è mostrato in Figura 1 Questa procedura prevede la dissezione della piastra basale, che comprende le basale decidua (Figura 1A – D). Il basalis decidua è ottenuto rimuovendo villi placentare (lato fetale) dalla piastra basale (Figura 1C). Il parietalis decidua viene raccolto raschiando delicatamente la membrana corionica (Figura 1E</stro…

Discussion

Caratterizzazione delle proprietà funzionali e fenotipiche di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale umano è essenziale per la comprensione dei meccanismi immunitari che portano a disturbi della gravidanza. Diverse tecniche sono state descritte per isolare leucociti dall'interfaccia materno-fetale durante la gravidanza umana ^{10,14,25,28,37,42,43.} Tuttavia, ciascuna di queste tecniche è distinta, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione,…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator