Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Беременность характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в репродуктивных тканях и на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis). Этот интерфейс анатомическая контакта между материнской и эмбриональных тканей; Таким образом, это иммунологическое местом действия во время беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода играют центральную роль в имплантации, обслуживание беременности, и сроки доставки. Таким образом, фенотипические и функциональные характеризации этих лейкоцитов обеспечит понимание механизмов, приводящих к нарушению беременности. Несколько протоколы были описаны для того, чтобы изолировать от проникновения лейкоцитов децидуальной базального и децидуальной parietalis; Однако, отсутствие согласованности в реагентов, энзимов, и времени инкубации затрудняет сравнение этих результатов. Описанный в настоящем документе, новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных диссметоды ociation сохранить жизнеспособность и целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. После этого протокола, выделенные лейкоциты могут быть использованы для определения метилирование ДНК, экспрессию генов-мишеней, в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. фагоцитоза, цитотоксичность, пролиферацию Т-клеток, и пластичности и т.д.), а также производство активных форм кислорода на границе материнской плода. Кроме того, с помощью описанного протокола, эта лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.

Introduction

Беременность характеризуется тремя различными иммунологическими фаз: 1) имплантация и в начале плаценты связаны с про-воспалительной реакции (т.е., имплантация напоминает "открытая рана"); 2) во втором триместре, и большинство из третьего триместра беременности, когда иммунного гомеостаза достигается через преимущественно противовоспалительным государства на границе материнской плода; и 3) роды, про-воспалительных состояние ^1-7. Иммунные клетки играют важную роль в регуляции воспалительной реакции на границе материнской плода, где их численность и изменение локализации во время беременности ^6-9.

У человека, интерфейс материнской плода представляет собой область непосредственного контакта между материнской (децидуальной) и плода (хориона или трофобласта) тканей. Этот интерфейс включает в себя: 1) децидуальной parietalis, что линии полости матки не распространяется на плаценту и в сопоставлениив хориона laeve; и 2) децидуальной базального, расположенные в базальной пластинки плаценты где она вторглась интерстициальными трофобластов ¹⁰ (рисунок 1). Интимность этих областях контакта создает условия для антигенной плода воздействия материнской иммунной системы ^11-13. Не удивительно, лейкоциты содержат до 30-40% клеток плаценты ^8,9,14,15 в дополнение к типичным стромальных клеток типа и железистых клеток ^8,14,16. Роль лейкоцитов на границе материнской плода включает несколько процессов, которые включают ограничение трофобласта вторжения ^17, реконструкцию спиральных артерий ^18,19, обслуживание материнской толерантности ^12,20, и посвящение труда ^21-26. Лейкоциты как адаптивных и врожденных конечностей иммунной системы, то есть, Т-клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты, дендритные клетки, и клетки NK, были определены в децидуальных тканей, и ихпропорции и статус активации, как было показано в пространственном и временном меняться в течение беременности ^{6-10,12,14,24,27-30.} Возмущения в популяции лейкоцитов и / или функции, связанные с самопроизвольным абортом, ³¹ преэклампсии ^32, внутриутробной задержки роста ^32,33 и преждевременных родов ^7,24. Таким образом, изучение фенотипических характеристик и функциональности лейкоцитов на границе материнской плода человека будет способствовать выяснению иммунологических путей Нарушение регуляции при нарушениях беременности.

Один из самых мощных инструментов, используемых для определения фенотипа и функциональных свойств лейкоцитов проточной цитометрии, технология, которая позволяет проводить количественный анализ нескольких параметров одновременно ^34-36. Для анализа лейкоцитов методом проточной цитометрии, изоляция лейкоцитов в одной клеточной суспензии требуется. Таким образом, способ отделить проникновения Leukocytes из интерфейса материнской плода необходимо изучить их фенотипические и функциональные свойства.

Некоторые методы были описаны, чтобы изолировать лейкоциты от человеческого материнской плода интерфейс ^{10,14,25,27,37-39.} В то время как некоторые применяются механические разукрупнение ^10,25,27,38, другие используют ферментативного расщепления ^37,40 для тканевой диссоциации. Из-за механической дезагрегации дает меньший выход и снижает жизнеспособность ⁴¹ и ферментативной диссоциации может повлиять на жизнеспособность клеточной поверхности и удержание маркера ^42, описанный здесь способ сочетает нежную механическую диссоциацию с ферментативной предварительной обработки, чтобы увеличить выход изолированных лейкоцитах без ущерба жизнеспособности клеток. Аналогичное сочетание методов была продемонстрирована эффективность в изоляции лейкоцитов из децидуальной ткани на материнской плода интерфейс ^39. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает мехаское разбивка с автоматической диссоциации ткани, что увеличивает согласованность, экономя время и труд по сравнению с традиционными измельчения с противоположными скальпелей, бритвенные лезвия, или хирургическими ножницами ^10,28. Фермент выбрали для ткани диссоциации был Accutase. В отличие от обычно используемого коллагеназы ^43, диспазу ^44, и трипсин ^45, Accutase (раствор клеток отряд) сочетает в себе как общие протеолитической и коллагенолитических мероприятий, способствующих эффективному пока нежным диссоциации ^46,47. После диссоциации, лейкоциты обогащены от общей численности населения децидуальных клеток центрифугированием в градиенте плотности. Различные градиент плотности носителя были ранее использованы, наиболее распространенным из которых являются перколлом (суспензии коллоидных частиц кремнезема) и ⁴⁸ (Ficoll полимер сахарозы с высокой молекулярной массой синтетической) ^49. Более высокая эффективность изоляции от сахарозы полимера была Previously показано ^50, и протокол, описанный в данном документе дополнительно доказывает, что этот градиент плотности носителя производит достаточно высокую чистоту мононуклеарных лейкоцитов.

Следовательно, протокол описано здесь сочетает в себе механическую ткани дезагрегации с автоматической диссоциации ткани, ферментативным расщеплением с раствором открепления клеток, лейкоцитов и разделения с градиентом плотности сред (1,077 + 0,001 г / мл), чтобы изолировать лейкоцитов из плаценты человека ткани. Этот протокол был доказан, чтобы сохранить антигены на поверхности клеток, а также жизнеспособности клеток. Выделенные лейкоциты могут быть использованы для различных приложений, которые включают иммунофенотипирование с проточной цитометрии и функциональных исследований в пробирке.

Protocol

Этот протокол подходит для изоляции лейкоцитов из децидуальной базального и децидуальной parietalis в подготовке к иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Кроме того, отдельные клетки могут быть использованы для сортировки клеток, культуры клеток, выделения РНК, и цитологи?…

Representative Results

. Рассечение тканей человека на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis) показано на рисунке 1 Эта процедура включает в себя вскрытие донца, которое включает децидуальной базального (рис 1А – D). Децидуальной базального получае?…

Discussion

Характеристика функциональных и фенотипических свойств проникновения лейкоцитов в интерфейсе материнской плода человека имеет важное значение для понимания иммунных механизмов, приводящих к нарушению беременности. Некоторые методы были описаны для того, чтобы изолировать лейкоци?…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator