Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Graviditet kännetecknas av infiltration av leukocyter i reproduktiva vävnader och på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis). Detta gränssnitt är den anatomiska platsen för kontakt mellan moderns och fostervävnader; därför är det en immunologisk ningsställe under graviditet. Infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt spelar en central roll vid transplantationer, graviditet underhåll och tidpunkten för leverans. Därför kommer fenotypiska och funktionella karakterisering av dessa leukocyter ge insikt i de mekanismer som leder till graviditet störningar. Flera protokoll har beskrivits för att isolera infiltrera leukocyter från decidua basalis och decidua parietalis; Men bristen på konsekvens i reagens, enzymer och inkubationstider gör det svårt att jämföra dessa resultat. Häri beskrivs är en ny metod som kombinerar användning av milda mekaniska och enzymatiska dissociation tekniker för att bevara livskraften och integritet extracellulära och intracellulära markörer i leukocyter isolerade från mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt. Bortsett från immunfenotypning, cellodling och cellsortering, de framtida tillämpningar av detta protokoll är många och varierande. Efter detta protokoll, kan de isolerade leukocyter användas för att bestämma DNA-metylering, uttryck av målgener, leukocyter vitro funktionalitet (dvs, fagocytos, cytotoxicitet, T-celltillväxt, och plasticitet, etc.) i, och produktionen av reaktiva syreradikaler på moder och foster gränssnitt. Dessutom, med hjälp av den beskrivna protokollet, har detta laboratorium kunnat beskriva nya och ovanliga leukocyter på moder och foster gränssnitt.

Introduction

Graviditet kännetecknas av tre distinkta immunologiska faser: 1) implantation och tidig placentation samband med en pro-inflammatorisk respons (dvs liknar implantation ett "öppet sår"); 2) den andra trimestern och det mesta av den tredje trimestern av graviditeten när immun homeostas uppnås genom en övervägande anti-inflammatoriskt tillstånd på moder och foster gränssnitt; och 3) förlossning, en pro-inflammatoriskt tillstånd ^1-7. Immunceller spelar en viktig roll i regleringen av det inflammatoriska svaret på moder och foster gränssnitt där deras förekomst och lokalisering förändring under hela graviditeten ^6-9.

Hos människa representerar moder till foster gränssnitt ett område för direktkontakt mellan moderns (decidua) och foster (chorion eller trofoblasten) vävnader. Detta gränssnitt innefattar: 1) decidua parietalis som linjer livmodern som inte omfattas av moderkakan och är i sammanställningtill chorion laeve; och 2) decidua basalis, som ligger i basalplattan av moderkakan där det invaderas av mellanrums trofoblaster ¹⁰ (Figur 1). Intimiteten av dessa kontaktytor skapar förutsättningar för foster antigen exponering för moderns immunförsvar ^11-13. Inte överraskande, leukocyter utgöra upp till 30-40% av de decidual cellerna ^8,9,14,15 utöver typiska stromal-typ celler och körtelceller ^8,14,16. Rollen av leukocyter på moder och foster gränssnitt omfattar flera processer som inkluderar begränsning av trofoblaster invasion ^17, ombyggnad av spiral artärer ^18,19, underhåll av moderns tolerans ^12,20, och initiering av arbetskraften ^21-26. Leukocyter för både adaptiva och medfödda lemmar i immunsystemet, det vill säga, T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler, dendritiska celler och NK-celler, har identifierats i decidual vävnader, och derasproportioner och aktiveringsstatus har visat sig variera spatialt och tidsmässigt hela dräktigheten ^{6-10,12,14,24,27-30.} Störningar i leukocytpopulationen och / eller funktion är associerade med spontan abort ^31, preeklampsi ^32, intrauterin tillväxthämning ^32,33, och för tidigt värkarbete ^7,24. Därför kommer studiet av de fenotypiska egenskaper och funktioner av leukocyter på mänskliga moder och foster gränssnitt underlätta klarlägga de immunologiska vägar dysreglerad i graviditetsstörningar.

En av de mest kraftfulla verktyg som används för att bestämma fenotypen och funktionella egenskaper hos leukocyter är flödescytometri, teknik som gör den kvantitativa analysen av flera parametrar samtidigt ^34-36. För att analysera leukocyter från flödescytometri, krävs isolering av leukocyter i en enkelcellsuspension. Därför ett sätt skilja infiltrerande leukocytes från moder till foster gränssnitt behövs för att studera deras fenotypiska och funktionella egenskaper.

Flera metoder har beskrivits för att isolera leukocyter från den humana moder och foster gränssnitt ^{10,14,25,27,37-39.} Medan vissa tillämpa mekanisk uppdelning ^10,25,27,38, andra använder enzymatisk digestion ^37,40 för vävnadsdissociering. Eftersom mekanisk uppdelning ger ett lägre utbyte och minskad livsduglighet ^41, och enzymatisk dissociation kan påverka viabiliteten och cellytmarkör retentionen ^42, den metod som beskrivs häri kombinerar försiktig mekanisk dissociation med enzymatisk förbehandling för att öka utbytet av isolerade leukocyter utan att äventyra cellviabilitet. En liknande kombination av metoder har visat sig vara effektiv vid isolering av leukocyter från de decidual vävnad vid moder och foster gränssnitt ^39. Därför protokollet beskrivet häri innebär mechaniska uppdelning med en automatisk vävnads dissociator som ökar konsekvens samtidigt som du sparar tid och arbete i jämförelse med traditionella mals med motsatta skalpeller, rakblad eller kirurgiska saxar ^10,28. Enzymet väljs för vävnadsdissociering var Accutase. Till skillnad från vanligt förekommande kollagenas ^43, dispas ^44, och trypsin ^45, Accutase (en cell lossnar lösning) kombinerar både allmän proteolytisk och kollagenolytiska aktiviteter som bidrar till en effektiv och skonsam dissociation ^46,47. Efter dissociation, är leukocyter anrikade från den totala befolkningen i de decidual cellerna genom densitetsgradientcentrifugering. Olika densitetsgradient medier har tidigare utnyttjats, den vanligaste av dessa är Percoll (en suspension av kolloidala kiseldioxidpartiklar) ⁴⁸ och Ficoll (en polymer av sackaros med en hög syntetisk molekylvikt) ^49. Den överlägsna effektivitet av isolering av den sackaros polymeren har varit previously visas ^50, och det protokoll som beskrivs häri ytterligare bevisar att detta densitetsgradient media ger en tillräckligt hög renhet av mononukleära leukocyter.

Följaktligen, det protokoll som beskrivs häri kombinerar den mekaniska vävnaden disaggregation med en automatisk vävnads dissociator, enzymatisk digerering med en cell avskildhet lösning och leukocyt separation med en densitetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) för att isolera leukocyter från humana decidual vävnader. Detta protokoll har visat sig bevara cellyteantigener tillsammans med cellviabilitet. De isolerade leukocyter kan användas för flera tillämpningar som inkluderar immunfenotypning med flödescytometri och funktionella studier in vitro.

Protocol

Detta protokoll är lämpligt för leukocyt isolering från decidua basalis och decidua parietalis som förberedelse för immunfenotypning genom flödescytometri. Vidare kan de isolerade cellerna kan användas för cellsortering, cellodling, RNA-isolering, och cytologi. Innan du arbetar med de prover som nämns i detta protokoll, måste mänsklig etiskt godkännande inhämtas från den lokala forskningsetiska kommittén och institutionella prövningsnämnder. Insamling och utnyttjande av mänskliga prover för forskning…

Representative Results

. Dissektion av mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis) visas i fig 1 Detta förfarande inbegriper dissektion av basalplattan, vilket inkluderar decidua basalis (Figur 1A – D). Decidua basalis erhålles genom avlägsnande av placenta-villi (fetalt sidan) från basalplattan (Figur 1C). Decidua parietalis uppsamlas genom att försiktigt skrapa den chorionic membran (figur 1E – <strong…

Discussion

Karakterisering av de funktionella och fenotypiska egenskaper hos infiltrerande leukocyter vid humana moder och foster gränssnitt är väsentlig för förståelsen av de immunmekanismer som leder till graviditetsstörningar. Flera tekniker har beskrivits för att isolera leukocyter från humant moder och foster gränssnitt under hela graviditeten ^{10,14,25,28,37,42,43.} Men var och en av dessa tekniker är distinkt, använder olika enzymer eller enzymkombinationer, kräver olika dissociation gånger, inte ange…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator