Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle
Summary
Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Abstract
Schwangerschaft wird durch die Infiltration von Leukozyten in der reproduktiven Gewebe und an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Decidua basalis und Dezidua parietalis) gekennzeichnet. Diese Schnittstelle ist der anatomischen Stelle der Kontakt zwischen Mutter und Fetus Gewebe; es ist daher ein immunologisches Wirkort während der Schwangerschaft. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus Schnittstelle spielen eine zentrale Rolle bei der Implantation, Schwangerschaft Wartung, und der Zeitpunkt der Lieferung. Daher werden phänotypische und funktionelle Charakterisierung dieser Leukozyten Einblick in die Mechanismen, die zu Schwangerschaftsstörungen führen werden. Verschiedene Protokolle haben, um zu isolieren infiltrierenden Leukozyten aus der Dezidua basalis und Dezidua parietalis beschrieben; Jedoch macht der Mangel an Übereinstimmung in den Reagenzien, Enzyme und Inkubationszeiten es schwierig, diese Ergebnisse zu vergleichen. Hierin wird ein neuartiger Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen diss kombiniertereinigung Techniken, um die Lebensfähigkeit und Integrität der extra- und intrazellulären Markern in Leukozyten aus den menschlichen Geweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle getrennt zu bewahren. Abgesehen von Immunphänotypisierung, Zellkultur und Zellsortierung, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind zahlreich und vielfältig. Nach diesem Protokoll können die isolierten Leukozyten verwendet werden, um DNA-Methylierung, die Expression von Zielgenen, in vitro Leukozyten Funktionalität (dh die Phagozytose, Zytotoxizität, T-Zellproliferation und Plastizität, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen an der Mutter und Fötus-Schnittstelle. Zusätzlich mit dem beschriebenen Protokoll wurde dieses Labor in der Lage, neue und seltene Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zu beschreiben.
Introduction
Schwangerschaft wird durch drei verschiedene immunologische Phasen gekennzeichnet: 1) der Implantation und der frühen Plazentation mit einer pro-inflammatorische Reaktion verbunden (dh der Implantation ähnelt eine "offene Wunde"); 2) dem zweiten Trimester und das meiste des dritten Trimesters der Schwangerschaft, wenn Immunhomöostase wird durch eine überwiegend anti-entzündlichen Zustand an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erreicht; und 3) der Geburt, einer pro-inflammatorischen Zustand 1-7. Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktion an der Mutter und Fötus-Schnittstelle, wo ihre Fülle und Lokalisierung Veränderung während der Schwangerschaft 6-9.
Bei Menschen, die Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt einen Bereich des direkten Kontakts zwischen mütterlichen (decidua) und fetale (Chorion oder Trophoblast) Gewebe. Diese Schnittstelle umfasst: 1) die Decidua parietalis, die Linien der Gebärmutterhöhle nicht von der Plazenta bedeckt und in Juxtapositionauf die Chorion laeve; und 2) der Dezidua basalis, in der Basalplatte der Plazenta, wo es durch interstitielle Trophoblasten 10 (1) eingedrungen entfernt. Die Intimität dieser Kontaktbereiche schafft die Voraussetzungen für die fetale Antigen-Exposition gegenüber dem mütterlichen Immunsystem 11-13. Nicht überraschend, umfassen Leukozyten bis zu 30-40% der Deciduazellen 8,9,14,15 neben typischen Stromazellen Typzellen und Drüsenzellen 8,14,16. Die Rolle der Leukozyten bei der mütterlich-fötalen Grenzfläche umfasst mehrere Prozesse, für die Begrenzung der Trophoblastinvasion 17, Umbau von Spiralarterien 18,19, Wartung der mütterlichen Toleranz 12,20 und Initiierung der Arbeits 21-26 enthalten. Leukozyten sowohl des adaptiven und angeborenen Schenkel des Immunsystems, dh T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen, B-Zellen, dendritische Zellen und NK-Zellen, sind in den decidual Geweben identifiziert worden, und ihreProportionen und Aktivierungsstatus wurde gezeigt, räumlich und zeitlich während der Gestation 6-10,12,14,24,27-30 variieren. Störungen in der Leukozyten-Population und / oder Funktion sind mit Spontanabort 31, Präeklampsie 32, intrauterine Wachstumsrestriktion 32,33 und Frühgeburt 7,24 verbunden. Daher wird die Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften und Funktionen von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle die Aufklärung der immunologischen Wege in Schwangerschaftsstörungen fehlreguliert zu erleichtern.
Eine der leistungsfähigsten Werkzeuge verwendet, um den Phänotyp und funktionellen Eigenschaften der Leukozyten zu bestimmen, ist Durchflusszytometrie Technologie, die die quantitative Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig 34-36 ermöglicht. Leukozyten durch Durchflusszytometrie analysiert, wird die Isolierung der Leukozyten in einer Einzelzellsuspension benötigt. Daher ist ein Verfahren zur Abtrennung infiltrierenden leukocytes von der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt wird, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu studieren.
Es wurden mehrere Verfahren beschrieben worden, um Leukozyten aus dem menschlichen maternofetalen Schnittstelle 10,14,25,27,37-39 isolieren. Während einige gelten mechanische Aufschlüsselung 10,25,27,38, andere verwenden enzymatische Verdauung 37,40 für Gewebedissoziation. Da mechanische Zerlegung erzeugt eine geringere Ausbeute und verminderte Lebensfähigkeit 41 und enzymatische Dissoziation kann Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker Retention 42 beeinflussen, die hier beschriebene Methode kombiniert sanfte mechanische Dissoziation mit enzymatische Vorbehandlung, die Ausbeute an isolierten Leukozyten, ohne dabei die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Eine ähnliche Kombination von Methoden nachgewiesen wurde als wirksam bei der Isolation von Leukozyten aus der Dezidua-Gewebe an der mütterlich-fötalen Grenzfläche 39 ist. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet mechanische Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit, wenn die traditionellen Fleischwolf gegenüber gegnerischen Skalpelle, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren 10,28. Die für Gewebedissoziation gewählten Enzym war Accutase. Anders als häufig verwendete Kollagenase 43, Dispase 44 und Trypsin 45, Accutase (a Zellablösung Lösung) kombiniert sowohl allgemeine proteolytischen und kollagenolytische Aktivitäten, die für eine effiziente und dennoch schonende Dissoziation 46,47 beizutragen. Nach Dissoziation werden die Leukozyten aus der Gesamtbevölkerung der Deciduazellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Verschiedene Dichtegradientenmedien zuvor verwendet worden, von denen die häufigsten sind Percoll (eine Suspension von kolloidalen Siliciumdioxidteilchen) 48 und Ficoll (ein Polymer aus Saccharose mit einem hohen synthetischen Molekulargewicht) 49. Die überlegene Effizienz der Trennung von der Saccharose Polymer wurde previonuierlich 50 gezeigt, und die hierin weiter beschriebenen Protokoll beweist, dass diese Dichtegradientenmedien erzeugt eine ausreichend hohe Reinheit von mononukleären Leukozyten.
Daher ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die mechanische Gewebe Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, enzymatische Verdauung mit einer Zellentfernungslösung und Leukozyten-Trennung mit einem Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml), um Leukozyten aus menschlichen Dezidua-Gewebe zu isolieren. Dieses Protokoll ist nachgewiesen worden, Zelloberflächenantigene zusammen mit Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Die isolierten Leukozyten kann für mehrere Anwendungen, die Immunphänotypisierung mit der Durchflusszytometrie und funktionelle Untersuchungen in vitro zählen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Charakterisierung der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften der Infiltration von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle ist wesentlich für das Verständnis der Immunmechanismen, um eine Schwangerschaft zu Störungen führen. Es wurden mehrere Techniken, um Leukozyten aus dem menschlichen mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 10,14,25,28,37,42,43 isolieren beschrieben. Jedoch jede dieser Techniken unterscheidet, verwendet verschiedene Enzyme oder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development, NIH / DHHS unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt, teilweise von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal-Kind-Gesundheit. Wir danken Maureen McGerty (Wayne State University) für ihre kritische Messwerte des Manuskripts.
Materials
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |
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