We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d'une surface par balayage sur une zone de l'échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine 1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l'échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques – y compris les protéines, l'ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l'analyse des échantillons fixés dans l'air ou de l'état quasi-native dans un liquide 2-5.
Outre sa capacité d'imagerie à haute résolution dans l'ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d'interaction (d'adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l'échantillon 5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l'échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu'à ce qu'il perd le contact avec l'échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l'applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d'élasticité pour mesurer la rigidité d'un matériau, et les forces d'adhérence peuvent être obtenues.
Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d'un support solide – habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium 7 oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating 8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées 10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions 11 à 15.
Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d'approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L'épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force 6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN 6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d'insaturation) et modifié par des agents de la membrane 16 actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué 17 et d'autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d'approche affectent également la force de percée 15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques 11,19, les changements de composition dépendant 12,20, ainsi que des effets d'autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane 21.
Le plat d'orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d'autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface 22 et la microscopie à fluorescence 11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes.
Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l'AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L o) et désordonnés (L) d phases liquides ont été caractérisées 11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d'autres processus cellulaires 23,24.
SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L D et L o phases. La phase L o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de 11 Ld. La séparation de la L o L d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circ…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, le cancer Centre allemand de recherche, l'Université de Tübingen, et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (accorder. Pas 0312040).
Nous remercions Eduard Hermann de nous aider à automatiser l'analyse des données de la courbe de la force et le Dr Jakob Suckale la lecture attentive de ce manuscrit.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |