כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) מייצר תמונה של פני השטח על ידי סריקה על פני שטח של המדגם באמצעות שלוחה עם קצה חד מאוד 1. התנועה של שלוחה חוקרת את הטופולוגיה של מדגם המשטח. AFM כבר מיושם באופן נרחב למולקולות ביולוגיות – כוללים חלבונים, DNA, וקרומים, בשל צדדיות שלה בניתוח דגימות קבועות באוויר או מצב כמעט טבעי בנוזל 2-5.
מלבד יכולת ההדמיה ברזולוציה הגבוהה שלה בטווח ננומטר, שלוחה AFM פועלת כקפיץ לחקור כוחות אינטראקציה (הידבקות ודחייה) ותכונות מכאניות של המדגם 5,6. התופעה זו ידועה בכח ספקטרוסקופיה. במצב זה, החללית מתקרבת ראשונה המדגם ומפעילה כוח על זה, ואז הוא חזר עד שהוא מאבד קשר עם המדגם (איור 1 א). עקומות שנוצרו להראות כוח כפונקציה של מרחק של שלוחה לשתי האפליקציהמקק והכחשה. מספר נכסים כוללים מודולוס האלסטיות למדוד את הנוקשות של חומר, וניתן לגזור כוחות ההידבקות.
bilayers שומנים הנתמכים הם קרומים ביולוגיים מודל שוכבים על גבי תמיכה מוצקה – בדרך כלל נציץ,, סיליקה הזכוכית בורוסיליקט התמזגה, או חמצון סיליקון 7. הם מוכנים תוך שימוש בטכניקות שונות כמו בתצהיר שלפוחית, שיטת אנגמיור-באגט וספין-ציפוי 8,9. ההדמיה AFM נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר היווצרות bilayers הנתמכות הבאות 10, ולחקור מבנים שונים שהוקמו על ידי קרומים של קומפוזיציות שונות 11-15.
ביצוע כוח ספקטרוסקופיה על תוצאות bilayers נתמכות בשיא בעקומת הגישה. שיא זה מצביע על הכוח הדרוש כדי לחדור את bilayer, והוא נקרא כוח פריצת דרך. עובי bilayer גם ניתן למדוד באמצעות כוח העקומה 6. כוח הפריצה האופייני של bilayersטווח שבין 1-50 ננ 6. מאפיינים אלה תלויים באריזת שומנים (שלב נוזלי או ג'ל) ומבנה (אורך שרשרת acyl ומידת unsaturation) ושונה על ידי סוכני קרום פעיל 16. התאוריה מאחורי הקרע הוסברה 17 ופרמטרים ניסיוניים אחרים כגון רכות שלוחה, רדיוס קצה ומהירות גישה משפיעים גם על כוח פריצת הדרך 15,16,18. ספקטרוסקופיה הכוח נעשתה שימוש כדי לנתח את התכונות של שלבים שונים שומנים 11,19, שינויי הרכב תלוי 12,20, כמו גם השפעות של מולקולות ביולוגיות אחרות, כמו פפטידים, ביציבות של הקרום 21.
הנטייה השטוחה של bilayers נתמכת היא יתרון עבור שילוב AFM עם שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה תהודת 22 וקרינת המשטח plasmon 11,19 לאפיין מבנה ותכונות של ממברנות טובות יותר.
פרוטו וידאו מפורט זהcol נועד להכין bilayers שומנים נתמכים באמצעות תצהיר שלפוחית ולנתח אותם עם AFM והכח ספקטרוסקופיה. בעוד שלפוחית בגדלים שונים ניתן להשתמש כדי להכין bilayers, פרוטוקול זה מתמקד בשלפוחית unilamellar קטנה וגדולה. bilayers נתמכת ששלב להפריד לנוזל הורה (o L) ושלבים נוזליים סדר (ד L) התאפיינה 11,15. הקרום מורכב מdi-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC), sphingomyelin (SM), וכולסטרול (חול) בשעה 2: יחס 1: 2. דגמי הרכב זה רפסודות השומנים בדם, אשר הציעו להתנהג כפלטפורמות חשובות לסחר בחלבון ומיון, איתות תא ותהליכים תאיים אחרים 23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBs המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) נוצרו על נציץ לאחר ספיחת שלפוחית וקרע שנגרם על ידי סידן כלורי. הרכב שומנים בדם זה מופרד לשלבי ד L וo L. שלב o L מועשר בsphingomyelin וכולסטרול, והוא / (איור 1 א) נוזל צמיג פחות יותר מאשר שלב ד L 11. הפרדת o L משל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק, המרכז הגרמני לחקר הסרטן, אוניברסיטת טובינגן, וBundesministerium für Bildung und Forschung (מענק לא. 0,312,040).
אנו מודים אדוארד הרמן שעזרו לנו להפוך את ניתוח נתוני כוח עקומת וד"ר יעקב Suckale לקריאה זהירה של כתב היד הזה.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. . Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. . ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -. J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -. J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
