We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) מייצר תמונה של פני השטח על ידי סריקה על פני שטח של המדגם באמצעות שלוחה עם קצה חד מאוד 1. התנועה של שלוחה חוקרת את הטופולוגיה של מדגם המשטח. AFM כבר מיושם באופן נרחב למולקולות ביולוגיות – כוללים חלבונים, DNA, וקרומים, בשל צדדיות שלה בניתוח דגימות קבועות באוויר או מצב כמעט טבעי בנוזל 2-5.
מלבד יכולת ההדמיה ברזולוציה הגבוהה שלה בטווח ננומטר, שלוחה AFM פועלת כקפיץ לחקור כוחות אינטראקציה (הידבקות ודחייה) ותכונות מכאניות של המדגם 5,6. התופעה זו ידועה בכח ספקטרוסקופיה. במצב זה, החללית מתקרבת ראשונה המדגם ומפעילה כוח על זה, ואז הוא חזר עד שהוא מאבד קשר עם המדגם (איור 1 א). עקומות שנוצרו להראות כוח כפונקציה של מרחק של שלוחה לשתי האפליקציהמקק והכחשה. מספר נכסים כוללים מודולוס האלסטיות למדוד את הנוקשות של חומר, וניתן לגזור כוחות ההידבקות.
bilayers שומנים הנתמכים הם קרומים ביולוגיים מודל שוכבים על גבי תמיכה מוצקה – בדרך כלל נציץ,, סיליקה הזכוכית בורוסיליקט התמזגה, או חמצון סיליקון 7. הם מוכנים תוך שימוש בטכניקות שונות כמו בתצהיר שלפוחית, שיטת אנגמיור-באגט וספין-ציפוי 8,9. ההדמיה AFM נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר היווצרות bilayers הנתמכות הבאות 10, ולחקור מבנים שונים שהוקמו על ידי קרומים של קומפוזיציות שונות 11-15.
ביצוע כוח ספקטרוסקופיה על תוצאות bilayers נתמכות בשיא בעקומת הגישה. שיא זה מצביע על הכוח הדרוש כדי לחדור את bilayer, והוא נקרא כוח פריצת דרך. עובי bilayer גם ניתן למדוד באמצעות כוח העקומה 6. כוח הפריצה האופייני של bilayersטווח שבין 1-50 ננ 6. מאפיינים אלה תלויים באריזת שומנים (שלב נוזלי או ג'ל) ומבנה (אורך שרשרת acyl ומידת unsaturation) ושונה על ידי סוכני קרום פעיל 16. התאוריה מאחורי הקרע הוסברה 17 ופרמטרים ניסיוניים אחרים כגון רכות שלוחה, רדיוס קצה ומהירות גישה משפיעים גם על כוח פריצת הדרך 15,16,18. ספקטרוסקופיה הכוח נעשתה שימוש כדי לנתח את התכונות של שלבים שונים שומנים 11,19, שינויי הרכב תלוי 12,20, כמו גם השפעות של מולקולות ביולוגיות אחרות, כמו פפטידים, ביציבות של הקרום 21.
הנטייה השטוחה של bilayers נתמכת היא יתרון עבור שילוב AFM עם שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה תהודת 22 וקרינת המשטח plasmon 11,19 לאפיין מבנה ותכונות של ממברנות טובות יותר.
פרוטו וידאו מפורט זהcol נועד להכין bilayers שומנים נתמכים באמצעות תצהיר שלפוחית ולנתח אותם עם AFM והכח ספקטרוסקופיה. בעוד שלפוחית בגדלים שונים ניתן להשתמש כדי להכין bilayers, פרוטוקול זה מתמקד בשלפוחית unilamellar קטנה וגדולה. bilayers נתמכת ששלב להפריד לנוזל הורה (o L) ושלבים נוזליים סדר (ד L) התאפיינה 11,15. הקרום מורכב מdi-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC), sphingomyelin (SM), וכולסטרול (חול) בשעה 2: יחס 1: 2. דגמי הרכב זה רפסודות השומנים בדם, אשר הציעו להתנהג כפלטפורמות חשובות לסחר בחלבון ומיון, איתות תא ותהליכים תאיים אחרים 23,24.
SLBs המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) נוצרו על נציץ לאחר ספיחת שלפוחית וקרע שנגרם על ידי סידן כלורי. הרכב שומנים בדם זה מופרד לשלבי ד L וo L. שלב o L מועשר בsphingomyelin וכולסטרול, והוא / (איור 1 א) נוזל צמיג פחות יותר מאשר שלב ד L 11. הפרדת o L משל?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק, המרכז הגרמני לחקר הסרטן, אוניברסיטת טובינגן, וBundesministerium für Bildung und Forschung (מענק לא. 0,312,040).
אנו מודים אדוארד הרמן שעזרו לנו להפוך את ניתוח נתוני כוח עקומת וד"ר יעקב Suckale לקריאה זהירה של כתב היד הזה.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |