We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) एक बहुत तेज टिप 1 के साथ एक ब्रैकट का उपयोग कर नमूने की एक क्षेत्र भर में स्कैनिंग द्वारा एक सतह की एक छवि उत्पन्न करता है। ब्रैकट के आंदोलन के नमूने की सतह टोपोलॉजी को जांचता है। तरल 2-5 में हवा या पास देशी राज्य में तय नमूनों का विश्लेषण में अपनी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, प्रोटीन, डीएनए, और झिल्ली सहित – AFM के लिए व्यापक रूप से जैविक अणुओं के लिए लागू किया गया है।
इसके अलावा नैनोमीटर रेंज में अपने उच्च संकल्प इमेजिंग क्षमता से, AFM ब्रैकट बातचीत बल (आसंजन और प्रतिकर्षण) और नमूना 5,6 के यांत्रिक गुणों की जांच के लिए एक वसंत के रूप में कार्य करता है। इस बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में जाना जाता है। इस मोड में, जांच के पहले यह नमूना (चित्रा 1 ए) के साथ संपर्क खो देता है जब तक फिर मुकर गया है, नमूना दृष्टिकोण और उस पर एक बल डाल रही है। उत्पन्न घटता एप्लिकेशन दोनों के लिए ब्रैकट की दूरी के एक समारोह के रूप में बल दिखानेएक प्रकार की मछली और त्याग। लोचदार मापांक सहित कई गुण एक सामग्री की कठोरता को मापने के लिए, और आसंजन बलों प्राप्त किया जा सकता है।
समर्थित लिपिड bilayers एक ठोस समर्थन के शीर्ष पर झूठ बोल जैविक मॉडल झिल्ली हैं – आम तौर पर अभ्रक, borosilicate ग्लास, सिलिका, या सिलिकॉन 7 ऑक्सीकरण। वे पुटिका बयान की तरह विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं, Langmuir-Blodgett विधि और 8,9 स्पिन कोटिंग। AFM इमेजिंग इन समर्थित bilayers 10 के गठन का पालन करें, और विभिन्न रचनाओं 11-15 की झिल्ली द्वारा गठित विभिन्न संरचनाओं की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है।
दृष्टिकोण की अवस्था में एक चोटी में समर्थित bilayers परिणामों पर बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन। इस शिखर बाईलेयर बेध करने के लिए आवश्यक बल को इंगित करता है, और सफलता के बल कहा जाता है। बाईलेयर मोटाई भी बल वक्र 6 का उपयोग करके मापा जा सकता है। bilayers के विशिष्ट सफलता बल1-50 के बीच सीमा एन 6। इन गुणों के लिपिड पैकिंग (तरल या जेल चरण) और संरचना (एसाइल श्रृंखला लंबाई और unsaturation की डिग्री) और झिल्ली सक्रिय एजेंटों 16 द्वारा बदल पर निर्भर करते हैं। टूटना पीछे सिद्धांत 17 समझाया गया है और इस तरह के ब्रैकट कोमलता, टिप त्रिज्या और दृष्टिकोण गति के रूप में अन्य प्रयोगात्मक मानकों को भी सफलता बल 15,16,18 प्रभावित करते हैं। बल स्पेक्ट्रोस्कोपी झिल्ली 21 की स्थिरता पर, विभिन्न लिपिड चरणों 11,19, पेप्टाइड्स की तरह संरचना पर निर्भर परिवर्तन 12,20, साथ ही अन्य biomolecules के प्रभाव, के गुणों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
समर्थित bilayers के फ्लैट अभिविन्यास बेहतर संरचना और झिल्ली के गुणों को चिह्नित करने के लिए इस तरह की सतह plasmon अनुनाद 22 और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 11,19 के रूप में अन्य तरीकों के साथ AFM के संयोजन के लिए लाभदायक है।
इस विस्तृत वीडियो आद्यकर्नल पुटिका बयान का उपयोग कर समर्थित लिपिड bilayers तैयार करने और AFM और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ उनका विश्लेषण करने का इरादा है। विभिन्न आकारों की पुटिकाओं bilayers तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल के छोटे और बड़े unilamellar पुटिकाओं पर केंद्रित है। चरण तरल का आदेश दिया (एल ओ) और तरल अव्यवस्थित (एल डी) चरणों में अलग समर्थन किया है कि bilayers 11,15 विशेषता थे। : 2: 1 के अनुपात झिल्ली 2 में डि-oleoyl-Phosphatidylcholine (DOPC), sphingomyelin (एस), और कोलेस्ट्रॉल (चोल) से बना है। इस रचना मॉडल प्रोटीन की तस्करी और छँटाई, कोशिका संकेतन और अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं 23,24 के लिए महत्वपूर्ण प्लेटफॉर्म के रूप में व्यवहार करने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं जो लिपिड राफ्ट,।
DOPC से बना SLBs: एसएम: चोल (2: 2: 1) कैल्शियम क्लोराइड द्वारा प्रेरित पुटिका सोखना और टूटना के बाद मीका पर गठन किया गया। इस लिपिड रचना एल डी एल ओ चरणों में अलग कर दिया। एल ओ चरण sphingomyelin और कोलेस्ट्रॉल में ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम (नं। 0,312,040 अनुदान) मैक्स प्लैंक सोसायटी, जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर, विश्वविद्यालय के Tübingen, और Bundesministerium फर Bildung अंड Forschung द्वारा समर्थित किया गया।
हम हमें इस पांडुलिपि की सावधान पढ़ने के लिए बल की अवस्था डेटा और डॉ जैकब Suckale के विश्लेषण को स्वचालित मदद करने के लिए एडवर्ड हरमन धन्यवाद।
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |