We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Atomic Force Microscopy (AFM) genererer et bilde av en overflate ved å scanne over et område av prøven ved hjelp av en utligger med en meget skarp spiss 1. Bevegelsen av cantilever sonder overflaten topologien av prøven. AFM har blitt mye brukt til biologiske molekyler – inkludert proteiner, DNA og membraner, på grunn av sin allsidighet i å analysere faste prøver i luft eller tilnærmet opprinnelig tilstand i flytende 2-5.
Bortsett fra den høye oppløsning avbildning i nanometerområdet, fungerer AFM cantilever som en fjær for å sondere interaksjonskreftene (vedheft og frastøting) og mekaniske egenskapene til prøven 5,6. Dette er kjent som kraft-spektroskopi. I denne modusen sonden først nærmer prøven og utøver en kraft på den, og er trukket tilbake inntil den mister kontakt med prøven (figur 1A). De genererte kurver viser kraft som en funksjon av avstanden av braket for både appmort og tilbaketrekking. Flere egenskaper inkludert elastisitetsmodulen for å måle stivheten av et materiale, og adhesjonskreftene kan utledes.
Støttede lipidbilag er biologiske modell membraner som ligger på toppen av en solid støtte – vanligvis glimmer, borsilikatglass, smeltet silisiumdioksid, eller oksidert silisium 7. De er forberedt ved hjelp av ulike teknikker som vesikkel deponering, Langmuir-Blodgett metode og spin-belegg 8,9. AFM avbildning har blitt brukt for å følge dannelsen av disse støttede bilag 10, og sonden ulike strukturer dannet av membraner av forskjellige sammensetninger 11-15.
Utøvende kraft spektroskopi på støttede dobbeltlag resulterer i en topp i tilnærmingen kurve. Denne topp indikerer den kraft som er nødvendig for å stikke hull i bilaget, og kalles gjennombrudd kraft. Den to-lags tykkelse kan også måles ved hjelp av den kraft som kurve 6. Den typiske gjennombrudd kraft bilagrange mellom 1-50 Nn 6. Disse egenskapene er avhengig av lipid pakning (væske eller gel fase) og struktur (acylkjedelengde og grad av umettethet) og endret ved membranaktive midler 16. Teorien bak bruddet har blitt forklart 17 og andre eksperimentelle parametre som cantilever mykhet, tannradius og tilnærming hastighet påvirker også gjennombruddet kraft 15,16,18. Force spektroskopi har blitt brukt til å analysere egenskapene til ulike faser lipid 11,19, sammensetning avhengige endringer 12,20, så vel som effekten av andre biomolekyler, for eksempel peptider, på stabiliteten av 21 membranen.
Den flate orientering av støttede dobbeltlag er fordelaktig for å kombinere AFM med andre metoder slik som overflate-plasmonresonans 22 og fluorescens mikroskopi 11,19 for bedre å karakterisere strukturen og egenskapene til membraner.
Denne detaljerte video protocol er ment å forberede lipid bilag som støttes ved hjelp av vesikkel-avleiring og analysere dem med AFM og kraft-spektroskopi. Mens vesikler av forskjellige størrelser kan anvendes for å fremstille bilag, fokuserer denne protokollen på små og store unilamellære vesikler. Støttede bilag at fase skille til flytende bestilt (L o) og flytende uordnede (L d) faser ble preget 11,15. Membranen består av di-oleoyl-fosfatidylcholin (DOPC), sfingomyelin (SM), og kolesterol (Chol) på 2: 2: 1-forhold. Denne sammensetningen modeller lipid flåter, som er foreslått til å oppføre seg som plattformer viktige for protein trafficking og sortering, celle signalisering og andre cellulære prosesser 23,24.
SLBs sammensatt av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ble dannet på glimmer etter vesikkel adsorpsjon og brudd fremkalt av kalsiumklorid. Denne lipidsammensetning separeres i D- og L L o faser. L o Fasen anriket på sphingomyelin og kolesterol, og er mindre væske / mer viskøst (figur 1A) enn L d fasen 11. Separasjonen av L o L d fra fase manifesterer seg som sirkelformede strukturer hevet over den omgivende (figur 1 B, C).</st…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society, den tyske Cancer Research Center, University of Tübingen, og Bundesministerium für Bildung und Forschung (gi nr. 0312040).
Vi takker Eduard Hermann for å hjelpe oss med automat analysen av styrken kurven data og Dr. Jakob Suckale for forsiktig tolkning av dette manuskriptet.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |