咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します
Summary
Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.
Abstract
発生中の胚の咽頭中胚葉は、頭と心筋組織の広範な地域に貢献しています。我々は、ex vivoで （も鰓のアーチと呼ばれる）咽頭弓で頭と心前駆細胞の発達を研究するための新規な方法を開発しました。この方法を使用して、我々は最近、第二の咽頭弓が自己複製心臓前駆細胞が含まれており、マウスの心臓の開発中に前駆細胞の拡大のための微小環境として機能することを記載しています。前駆細胞は、アーチの内側未分化と広大なままであるが、すぐに彼らはアーチの外に移動するような機能心筋細胞になります。また、最初の咽頭弓は弓を離れた後の筋管を生じさせる筋肉前駆細胞が含まれていることを報告しました。ここでは、解剖とマウス胚の開発からの第1および第2の咽頭弓のex vivo培養のための手順を示しています。この方法は、頭と心前駆/ devの筋肉を研究することを可能ex vivoで詳細に心筋細胞および筋管形成を含むelopment、。
Introduction
咽頭中胚葉細胞は、心臓の部品や咽頭の筋肉を生じさせます。胚発生の間に、第2の心臓フィールドから多能心臓前駆細胞は、咽頭中胚葉から移行し、心臓流出路および右心室を移入し、それらの異常な発達は密接先天性心疾患、先天性欠損症の主な原因と出生defect-に関連付けられていますヒト1-3関連死。最近の研究では、咽頭中胚葉が中胚葉心臓頭蓋顔面の開発4の重要な部分作る、心臓に加えて、筋肉を頭に寄与することを実証しました。このように、誘導、増殖、および咽頭中胚葉で頭と心前駆細胞の分化を含む発達プロセスは、活発な調査5-7中です。
最近まで、心臓前駆細胞は、拡張withoを受けるかどうかは不明のままで部分的には、それらの細胞環境に関する情報の欠如UT分化。我々の最近の研究では、咽頭のアーチは、心臓や筋肉前駆細胞の更新のための微小環境として機能し、数週間かけて8 ex vivoで培養することができることを示唆しています。この外植法は心臓頭蓋顔面前駆細胞ex vivoでの開発を研究するための新規かつユニークな機会を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオでは、我々は9.5日の咽頭弓古いマウス胚第一および第二の単離および培養する方法を示します。咽頭のアーチは、最初のアーチ8を第二のアーチとヘッド筋前駆細胞-in胚10,11の間に心臓をするために、マルチ強力な心臓前駆細胞ビルディングブロックを含む発生中の胚9のcraniolateral側に表示されるバルジを過渡セグメント化されています。
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).
Materials
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10cm petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 | |
References
- Kelly, R. G. The second heart field. Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
