Etablering av en klinisk relevant<em> Ex Vivo</em> Mock Cataract Surgery Modell for Gransker Epithelial Wound Reparasjon i Native mikromiljøet

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

Klinisk relevante, mock katarakt kirurgi, ble ex vivo epitelial sårheling modellen beskrevet her er utviklet for å tilveiebringe et verktøy for å undersøke mekanismene som regulerer reparasjon av epitelvev som respons på skade. Viktige funksjoner som ble rettet for å skape denne modellen inngår en) som gir vilkår som tett replikert in vivo respons på såret i en kultur setting, 2) lette å modulere de regulatoriske elementer av reparasjon, og 3) evne til bilde reparasjonsprosessen, i sin helhet, i sanntid. Utfordringen var derfor å skape en kultur modell hvor det var mulig å studere og manipulere, epitelial reparasjon sår i cellens opprinnelige mikromiljø. Tilgjengeligheten av dette såret-reparasjon modellen åpner nye muligheter for å identifisere de endogene signal signaler fra matrix proteiner, cytokiner og chemokiner som regulerer reparasjonsprosessen. I tillegg er modellen ideell for å undersøke hvordan enN epitelet er i stand til å bevege seg som et kollektiv ark for å re-epithelialize sårområdet ^2,3, og for bestemmelse av linjen av mesenchymale celler leder ved viklet kant som fungerer i å styre den kollektive migrering av skadde epitel ^4. Denne modellen gir også en plattform som brukes til å identifisere legemiddelselskap som kan fremme effektiv sårtilheling og hindre avvikende sår reparasjon ^5.

Det finnes allerede en rekke tilgjengelige såret-reparasjon modeller, både i kultur og in vivo, som har gitt det meste av det som er kjent om såret reparasjonsprosessen i dag. I dyremodeller skade, så som hornhinnen ^6-12 og ^13-17 hud, er det anledning til å studere responsen av vevet til såret i sammenheng med alle reparasjonsmediatorer som kan være involvert i prosessen, blant annet bidrag fra blodkar og nervesystemet. Det er imidlertid begrensninger manipulere experimentale tilstander in vivo, og det er ennå ikke mulig å foreta bildediagnostikk av reparasjonsrespons in vivo, kontinuerlig over tid. I motsetning til de fleste in vitro-sår-reparasjon kultur modeller, som for eksempel bunnen av såret, kan lett manipuleres og fulgt over tid, men mangler den miljøsammenheng studere sårheling i in vivo vev. Mens ex vivo-modeller har den fordelen av å studere skadereparasjonsprosessen kontinuerlig over tid i forbindelse med cellens mikro kombinert med evnen til å modulere den molekylære regulatorer av reparasjons som helst punkt i prosessen, er det få modeller som passer disse parametere.

Her beskrives en fremgangsmåte for å generere svært reproduserbare ex vivo epitelial sårheling kulturer som reproduserer en epitelvev respons på en fysiologisk såret. Bruke kylling embryo objektivet som en vev kilde, en ex vivo Mock katarakt operasjonen er utført. Objektivet er et ideelt vev å bruke for disse studiene, siden det er selvforsynt innen en tykk basalmembran kapsel, avascular, ikke innervert, og fri for eventuelle tilknyttede stroma ^18,19. I den humane sykdommen, løser katarakt kirurgi synstap på grunn av opasifisering av linsen, og innebærer fjerning av linsen fibercellemassen, som omfatter hoveddelen av linsen. Etter kataraktkirurgi visjon er gjenopprettet gjennom innsetting av en kunstig intraokulær linse. Katarakt kirurgi prosedyre, ved fjerning av fiberceller, induserer en skade respons i den tilstøtende linse epitel, som reagerer ved å re-epitelialisering av det bakre området av linsekapsel som hadde blitt okkupert av fibercellene. I katarakt kirurgi, som i de fleste sår reparasjon svar, er det noen ganger oppstår en avvik fibrotisk utfallet til sårtilheling respons, forbundet med fremveksten av myofibroblasts, som i objektivet er kjent som Bakre Capsule opasifikasjon ^20-22. For å generere katarakt kirurgi sårtilheling modell, er en katarakt kirurgi prosedyre etterlignet i linsene fjernet fra kylling embryo øyet å produsere en fysiologisk skade. Mikro fjerning av linsefiber celler resulterer i en meget konsistent sirkulært sårområdet omgitt av linsen epitelceller. Denne cellepopulasjonen forblir fast festet til linsebasalmembran kapselen og blir skadet av den kirurgiske prosedyren. Epitelceller migrere på ribbet området av endogen basalmembran å helbrede såret, ledet av en befolkning på vimentin rike mesenchymalceller kjent i reparasjonsprosessen som leder celler ^1. Med denne modellen responsen av et epitel for skade lett kan visualiseres og følges med tiden i forbindelse med cellens mikromiljø. Cellene er lett tilgjengelige for modifikasjoner av ekspresjonen eller aktivering av molekyler som forventes å spille en rolle i sårheling. En kraftig funksjon i ther modellen er evnen til å isolere og studere migrasjons-spesifikke forandringer i rammeverket av sårheling. Evnen til å fremstille store mengder av alderen passet ex vivo sårheling kulturer i studiene er en annen fordel med denne modellen. Dermed gir denne modellen systemet en unik mulighet til å erte hverandre mekanismer for sårheling og test therapeutics for deres effekt på sårtilheling prosessen. Den ex vivo uekte kataraktkirurgi modellen antas å ha bred anvendelse, noe som gir en kritisk ressurs for å studere skademekanismer reparasjon.

Protocol

Følgende protokoll i samsvar med Thomas Jefferson Universitetet Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer og med ARVO Statement for bruk av dyr i Vision Research. 1. Oppsett og klargjøring av objektiver for Ex Vivo Wound Culture Plasser tre 100 mm petriskåler i et sterilt, laminær hette. Fyll to av petriskåler halvveis med Tris / dekstrose-buffer (TD-buffer; 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-glukose, 8,25 mM Tris Bas…

Representative Results

Ex vivo modell for å studere laget sårhelingsprosessen i cellenes opprinnelige mikro For å undersøke mekanismene som er involvert i regulering sårtilheling av en epitel i cellene 'innfødte mikromiljø, ble en klinisk relevant ex vivo mock katarakt kirurgi modell laget. Denne modellen er laget av linseklut som tilbyr mange fordeler på grunn av sine iboende egenskaper: 1) objektivet er et selvstendig organ omgitt av en tykk basalmembran kalt linsekapsel; 2) det er …

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs,
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting
microscope