Establecimiento de un punto de vista clínico relevante<em> Ex Vivo</em> Catarata Mock Modelo de Cirugía en Investigando epitelial reparación de heridas en un microambiente Nativo

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

El, simulacro de cirugía de catarata clínicamente relevante, ex vivo modelo de curación de heridas epiteliales aquí descrito fue desarrollado para proporcionar una herramienta para la investigación de los mecanismos que regulan la reparación de los tejidos epiteliales en respuesta a una lesión. Las principales características que fueron destinadas para la creación de este modelo incluyen 1) proporcionar condiciones que replican de cerca la respuesta in vivo para herir en un entorno cultural, 2) la facilidad de la modulación de los elementos reguladores de la reparación, y 3) capacidad de la imagen del proceso de reparación, en su totalidad, en tiempo real. El reto, por lo tanto, era crear un modelo de cultivo en el que era posible estudiar y manipular, reparación de la herida epitelial en microambiente nativa de las células. La disponibilidad de este modelo de herida de reparación de abre nuevas posibilidades para la identificación de las señales de señalización endógenos de la matriz de proteínas, citocinas y quimiocinas que regulan el proceso de reparación. Además, el modelo es ideal para examinar cómo unn epitelio es capaz de moverse como una lámina colectiva para volver a epitelizar el área de la herida ^2,3, y para determinar el linaje de células mesenquimales líder en el borde de la herida que funciona en la dirección de la migración colectiva del epitelio lesionado ^4. Este modelo también ofrece una plataforma con la que identificar terapias que podrían promover la cicatrización efectiva y prevenir la reparación de heridas aberrante ^5.

Ya hay una serie de modelos de heridas de reparación disponibles, tanto en la cultura como in vivo, que han proporcionado la mayor parte de lo que se conoce sobre el proceso de reparación de heridas hoy. En modelos de lesión de origen animal, tales como la córnea y la piel ^{6-12 13-17,} hay la oportunidad de estudiar la respuesta del tejido a heridas en el contexto de todos los mediadores de reparación que podrían estar involucrados en el proceso, incluyendo las contribuciones de la vasculatura y el sistema nervioso. Sin embargo, hay limitaciones a la manipulación de la expericondiciones mentales en vivo, y aún no es posible llevar a cabo estudios de imagen de la respuesta de reparación in vivo, de forma continua en el tiempo. En contraste, la mayoría de los modelos de cultivo in vitro de reparación de la herida, tales como la herida de cero, pueden ser fácilmente manipulados y siguieron a lo largo del tiempo, pero carecen el contexto ambiental de estudiar la cicatrización de heridas en el tejido in vivo. Mientras que los modelos ex vivo ofrecen la ventaja de estudiar el proceso de reparación de la lesión continua en el tiempo en el contexto de microambiente de las células junto con la capacidad de modular los reguladores moleculares de reparación en cualquier punto en el proceso de tiempo, hay pocos modelos que se ajustan a estos parámetros.

Aquí se describe un procedimiento para generar altamente reproducible ex vivo epitelial herida culturas que reproducen la respuesta de un tejido epitelial a una herida fisiológico de curación. Uso de la lente de embrión de pollo como una fuente de tejido, un ex vivo mock se lleva a cabo la cirugía de catarata. La lente es un tejido ideal para utilizar para estos estudios ya que es auto-contenida dentro de una cápsula gruesa membrana basal, avascular, no inervado, y libre de cualquier estroma asociado ^18,19. En la enfermedad humana, la cirugía de catarata se ocupa de la pérdida de la visión debido a la opacificación de la lente, y consiste en la extirpación de la masa celular de fibra de lente, que comprende el grueso de la lente. Después de la cirugía de cataratas visión se restaura mediante la inserción de una lente intraocular artificial. El procedimiento de la cirugía de cataratas, a través de la eliminación de las células de fibra, induce una respuesta lesión en el epitelio de la lente adyacente, que responde por la reepitelización de la zona posterior de la cápsula del cristalino que había sido ocupada por las células de fibra. En la cirugía de cataratas, como en la mayoría de las respuestas de reparación de la herida, hay a veces se produce un resultado fibrótica aberrante a la respuesta de cicatrización de heridas, asociado con la aparición de miofibroblastos, que en la lente que se conoce como Posterior Capsule opacificación ^20-22. Para generar el modelo de cicatrización de heridas cirugía de cataratas, un procedimiento de cirugía de cataratas es imitado en lentes retira del ojo de embrión de pollo para producir una lesión fisiológica. Remoción microquirúrgica de las células resultados de fibra de la lente en un área de la herida circular muy consistente rodeado por las células epiteliales de la lente. Esta población de células permanece firmemente unido a la cápsula de la membrana basal de la lente y se lesiona por el procedimiento quirúrgico. Las células epiteliales migran a la zona denudada de la membrana basal endógena para sanar la herida, dirigido por una población de células mesenquimales vimentina ricos conocidos en el proceso de reparación como células líder ^1. Con este modelo de la respuesta de un epitelio a la lesión puede ser visualizado y siguió con el tiempo en el contexto de microambiente de las células fácilmente. Las células son fácilmente accesibles a las modificaciones de la expresión o activación de moléculas espera que juegue un papel en la reparación de heridas. Una característica poderosa del XXes el modelo es la capacidad de aislar y estudiar los cambios a la migración específica en el marco de la cicatrización de heridas. La capacidad de preparar un gran número de cultivos in vivo de edad emparejados ex cicatrización de heridas para los estudios es otra ventaja de este modelo. De este modo, este modelo de sistema ofrece una oportunidad única de separar los mecanismos de reparación de la herida y la terapéutica de las pruebas para determinar su efecto sobre el proceso de cicatrización de la herida. Se espera que el modelo de la cirugía de cataratas ex vivo simulacro de tener una amplia aplicación, proporcionando un recurso crítico para el estudio de los mecanismos de reparación del daño.

Protocol

El siguiente protocolo cumple con las directrices de Animales Institucional de Cuidado y Uso Comité Thomas Jefferson University y con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Vision Research. 1. Instalación y Preparación de lentes para la Cultura ex vivo de la herida Coloque tres platos de 100 mm de Petri en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos de los platos de Petri a medio camino con tampón Tris / Dextrosa (tampón TD; NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 0…

Representative Results

Creado ex vivo modelo para estudiar el proceso de cicatrización de heridas en microambiente nativa de las células Para investigar los mecanismos implicados en la regulación de la cicatrización de heridas de un epitelio dentro microambiente nativa de las células, se ha creado un modelo de la cirugía de catarata clínicamente relevante ex vivo simulacro. Este modelo se crea a partir de tejido de lente que ofrece muchas ventajas, debido a sus propiedades intrínsecas: 1)…

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs,
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting
microscope