Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
再生医学和组织工程领域正在快速推进,在气管和肾脏再生两个显着的成就近期突破。在组织工程开发的生物材料变得更容易,有机会这样的协议转让给少专业实验室。一个字段底漆通过增加使用生物材料的受益是体外诊断。
体外研究是调查范围内的单细胞类型的细胞内信号通路的重要平台,并帮助划定潜在疾病的众多机制病理生理学。这些研究通常依靠单一细胞类型是作为组织培养塑料(TCP)的单层中培养;二维(2D)的刚性表面少得多的弹性和多孔比三维(3D)环境的细胞的组织或器官内暴露。动物模型历来Ëmployed确认体外发现也转化为整个组织的效果,而且还可以用来作为临床前平台来调查人类疾病。然而,物种间的差异破坏这种依赖动物模型在我们人类疾病的认识– 。例如,肺部疾病哮喘太多了解基于尽管人的条件和该模型之间的内在差异,包括几乎没有证据的气道平滑肌束的肥大细胞浸润,或用于动物内自发疾病发展的能力的小鼠模型模型3,4。也有关于使用动物模型被鼓励在英国和其他国家的伦理方面的考虑,与“更换,细化和减少”在动物实验的“3R原则”的标准。
一个有吸引力的替代办法是人体组织体外创作结构再演s至调查在单个单元成人细胞类型之间的合作性质。在3D多细胞结构存在于组织细胞中,每个内独特的微环境。细胞在TCP培养只允许细胞单层,无法复制这样的环境,或提供用于多细胞培养的能力的培养。生物材料发展提供了发展的机会,为细胞培养天然和合成的3D平台。脱细胞的ECM可用于三维细胞培养物时与其它细胞类型,包括干细胞1 recellularized,但是这样的协议可以是复杂的和耗时的,与组织有限很大程度上非人类来源和的可用性。其他协议允许更大的控制权产生如纳米压印,ECM沉积,细胞片技术,静电或细胞环境。创建静电纤维的直径范围从纳米到微米,R无纺布3D多孔垫eplicating天然细胞外基质的尺寸。静电支架越来越多地被用作3D细胞培养平台– 。静电纺丝参数的操纵允许复杂的控制脚手架特性,例如孔径大小,纤维直径,地形和对准,以及表面化学。这种参数的变化已经显示出直接影响细胞的粘附和生长,当细胞培养在隔离。
这些优点已被利用在本研究中,以允许多种细胞类型的培养作为单个三维组织构建物,使用气道支气管作为模型的三维组织结构。细支气管壁由三个主要区域( 图1)。粘膜是哪里呼吸道上皮细胞坐在空气 – 液体界面(ALI),提供了一个重要的屏障到外部环境。它们位于网状基底膜(RBM)的,紧密紧凑的ECM主要由collag恩四,perlecans和层粘连蛋白。子粘膜层被发现正下方的黏膜,由多种细胞类型,包括成纤维细胞,肌成纤维细胞和疾病状况下白细胞浸润的更多孔的区域。最后平滑肌束周围气道包裹以螺旋方式,并且由气道平滑肌(ASM)的对齐纸张的。这是平滑肌的控制气道张力相对收缩的状态。静电支架的肺系统内的就业人数,直到最近被限制在再生的目的;与静电气管更换被成功移植。虽然成功,这种治疗方法是有限的标号,其集中在气管由于组织的功能的相对简单的性质。用于体外诊断的气道模型的有限实施例的存在,并且主要集中在平滑肌收缩测量 。无毒和无正降解聚合物聚对苯二甲酸乙酯(PET)的先前已静电纺丝,并被用于本研究,以确保产生的可长期保存的支架,而不会降低(允许它们被使用的“现成的”),并且还适用超过更长的时间内稳定的细胞培养。我们小组先前的研究已经表明,采用基本静电协议三种变型中,三个单独的PET静电支架可制造以提供最佳的形貌用于培养呼吸道上皮,成纤维细胞和平滑肌细胞中隔离21,22及气道的共存上皮细胞和成纤维细胞22。纤维直径被认为大大地影响上皮功能22,以及纤维取向允许平滑肌21对准片材的产生。这些研究是在静态条件下彼此独立地执行。在本研究中,这些各色nt的支架,含完全分化成人细胞已被共培养一周在ALI在市售的生物反应器作为气道壁的三维部分,提供了生理学相关的体外模型来研究的气道细胞间的反应。虽然该协议是使用气道支气管作为模型系统,它可适于作为用于从其它器官的粘膜单元的三维共培养的平台。
到静电纺丝聚合物纤维相媲美的天然细胞外基质的结构特性的能力已经导致了许多天然或合成的聚合物,或聚合物共混物是静电重建这些环境中,。工艺参数(包括聚合物的选择,聚合物浓度,溶剂,针尖的距离和温度)都可以影响脚手架特性的操纵;然而,一些参数可以有比其他25载体性能影响更大。当改性的PET纤维的直径,我们发现的关键参数是聚合物的所用浓度,的速率将聚合物溶液进行电纺丝,并且针的直径。当静电排列的纤维的关键参数是用于(一个转动心轴)的收集方法,其速度在该心轴旋转。通过降低心轴转速每分钟60转,我们发现所产生的随机排列支架表现出更大的脚手架单formity相比静电到平坦集电板。
脱细胞的气道组织的特性进行了分析,为每个气道细胞类型的培养发展了各种支架形貌提供指导。纳米纤维是一个有吸引力的脚手架复制由于小孔径但高的总孔隙率,其允许增加代谢物扩散,同时限制蜂窝移动基底膜结构。9虽然优化静电参数,一个范围的PET浓度和流速进行了测试。最薄纤维使用6% 重量/体积的PET溶液,以前使用的其它基团来实现。然而,高含量的成珠,以及缺乏均匀性是恒定的问题。最初试图消除卷边收录加入阳离子表面活性剂,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),向溶液中以降低表面张力,和测试各种来源宠物。在加入表面活性剂的减少成珠的量,但不完全。在尝试了许多PET颗粒的商业来源,食品级饮料瓶使用PET,通过切割饮料瓶,并在DCM中溶解这些:TFA溶剂溶液。以此作为在PET源导致增加纤维的均匀性和在纤维成珠的降低。通过稍微增加溶液的浓度至8% 重量/体积 ,降低了针直径(18G至23G),我们一致地生产无缺陷的纳米纤维具有约250纳米的纤维直径。静电纳米纤维支架可以在领取高度静电作出支架困难的手工处理的芯棒。这是通过存储在铝箔支架纺纱机和在70%的IMS浸泡在使用前后好转。这显然有助于消散留下的静电过程中支架的残留静电荷。
提供顶级ographies类似于由气道壁内的三个主要的气道细胞类型所遇到的个体的微环境,碱性电纺丝协议是适于产生用于这些细胞类型三个独特的支架:通过静电缓慢,产生随机排列的纳米纤维浓度低的PET溶液,其上的上皮细胞接种(模仿RBM)。通过电纺丝以更快的速度较高浓度的PET溶液,产生随机排列微纤维(产生更多孔支架), 成纤维细胞接种(立即RBM的下方模仿子粘膜区域)。通过电纺丝的低浓度的PET溶液到一个高速旋转的心轴对准纳米纤维生产的,在其上取向的纤维方向,平滑肌细胞产生对准细胞片层。
增加纤维直径导致增加的孔径,从而允许更大的细胞penetratioN转换支架,从而帮助创造一个真实的3D环境。超细纤维的支架被用于成纤维细胞的培养在研究中,以确保细胞驻留在该支架内的多个平面。通过增加的PET浓度为30% 重量/体积 ,PET纤维具有2.5微米的平均直径被生产。更大直径的纤维(≈4微米)用35% 重量/体积的PET溶液生产,但支架厚度均匀性丧失,和单个纤维之间较高的变异是明显的。在超细纤维支架毛孔均较纳米纤维支架测量(10.45微米VS分别为1.43微米),更大的7倍,但电池还是静态播种提供了有限的细胞渗透。这是通过使用轨道混合器,显示先前是有效的方法,动态地接种细胞提高。
高度对准的纳米纤维支架被通过电10%创建重量/体积的PET溶液到芯轴转速为2000转(≈440米·分钟-1)。在PET浓度从8%增至以防止纤维显示出在较低浓度不规则的波浪状的形态。尽管提高浓度,对准纤维减少的平均纤维直径(216nm处相对于255纳米,对准与随机的)。心轴将纤维拉伸出来他们已经干燥前的高速是容易造成这种效果。的纤维的取向的影响的ASM细胞的对准,并且还具有关于在ASM细胞已在别处21特征在于其他生理效应。
这个协议的主要限制是不能图象活细胞上/中制备的初始细胞附着或分化在延长的时间期间不可能确定在不牺牲样品的支架。这意味着文化时期后最优化的发生; 即,修复荷兰国际集团的样本,然后测量细胞培养是否成功后没有细胞培养过程中 。观察支架在培养一个的AlamarBlue颜色变化(蓝色为粉红色)表示细胞存在和可行的,但效果不理想。静电更透明的聚合物如明胶可能有助于对支架可视化细胞。我们模型中的纳米纤维支架的电纺丝允许的气道RBM的复制,同样由致密纳米纤维上的上皮细胞存在的。先前已表明,结构的细胞可以通过纳米纤维支架22不迁移,虽免疫细胞能够(数据未显示)。虽然有利的特定细胞类型上的三维表面的培养(如上皮细胞和内皮细胞),这种预防结构性细胞迁移通过纳米纤维可以是有害的其它细胞类型的培养。由于平滑肌是无法通过迁移第Ë对齐纳米纤维支架我们组装的三层共培养的平滑肌和成纤维细胞层彼此面对(相对的对准脚手架分隔两个细胞类型)。虽然这可以使细胞在接近并置,目前的研究不能断定一种细胞类型(无论是成纤维细胞或平滑肌)是否会超过整层过更长时间的培养期。尽管有这些限制,已经开发了气管壁的一个可行的三 – 层模型,它提供了一个替代的平台来调查这些多种细胞类型之间的相互作用。类似的三层研究最近已经公布了,其中成纤维细胞内嵌入圆筒状胶原I水凝胶与平滑肌接种于腔表面17内的外表面和上皮细胞。这里开发将允许类似管状的静电支架的机械稳定性构造来形成,并且仍然是一个电流resea我们集团内RCH目标。虽然研究已集中在气道,内体份额几种器官这个基本的粘膜结构单元,并且通过修改所述居民在这项研究中强调的,类似的平台可以为含有基底膜部组织,包括血管,膀胱和开发角膜,其中,胶原为基础的多层次的模型已经使用。
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |