Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
תחום רפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות מתקדם ב, עם פריצות דרך בקנה הנשימה וכליות התחדשות שני הישגים אחרונים ראויים לציון. ביו-חומרים שפותחו בהנדסת רקמות הופכים להיות נגישים יותר, עם הזדמנויות להעברת פרוטוקולים כגון למעבדות פחות מיוחדות. תחום אחד דרוך ליהנות באמצעות הגברת שימוש בביו-חומרים הוא באבחון מבחנה.
במחקרי מבחנה הן פלטפורמה חשובה לחקור מסלולי איתות התוך תאיים בתוך תא-סוגים בודדים, וסייעו להתוות מנגנוני pathophysiologies מחלה רב. מחקרים אלה בדרך כלל מסתמכים על תאים מסוג אחד להיות מתורבת כמו monolayer על פלסטיק בתרבית רקמה (TCP); משטח דו ממדים (2D) נוקשה הרבה פחות אלסטי ונקבובי יותר מתאי הסביבה (3D) תלת ממדים נחשפים בתוך רקמה או איבר. מודלים של בעלי החיים היו באופן מסורתי דוארmployed כדי לאשר השפעות שנמצאו במבחנה גם לתרגם לכל רקמה, ויכול לשמש גם כפלטפורמות פרה-קליניות לחקור מחלות בבני אדם. עם זאת, הבדלים בין-מינים לערער הסתמכות זו על מודלים של בעלי חיים בהבנה של מחלות אנושיות שלנו -. לדוגמא, הרבה הבנה של אסטמה מחלת ריאות מבוססת על מודל של עכברים למרות הבדלים המהותיים בין מצבו של האדם ומודל זה כולל מעט עדויות של חדירת תא תורן של צרור שריר חלק בדרכי הנשימה, או את היכולת להתפתחות מחלה ספונטנית בתוך החיה מודל 3,4. ישנם גם שיקולים אתיים בנוגע לשימוש במודלים של בעלי חיים, עם התקן "3Rs" של "החלפה, עידון, והפחתה" בניסויים בבעלי חיים שעודדו בבריטניה ובמדינות אחרות.
חלופה אטרקטיבית תהיה השחזור של רקמה אנושית במבנה יצירת מבחנהים כדי לחקור את טבע שיתוף הפעולה בין סוגי תאי אדם בוגרים ביחידה אחת. תאים קיימים במבנים רב-תאיים 3D בתוך רקמה, כל אחד במייקרו-סביבה ייחודית. Culturing של תאים על TCP מאפשר רק התרבות של monolayers התא, מסוגל לשכפל סביבה זו, או לספק את היכולת לתרבות רב-תא. קידום Biomaterials מספק ההזדמנות לפתח שני פלטפורמות 3D טבעיות וסינתטיות לתרבית תאים. ECM decellularized יכול לשמש לתרבית תאי 3D כאשר recellularized עם תא-סוגים אחרים, כוללים תאי גזע 1, לעומת זאת פרוטוקולים כאלה יכולים להיות מורכבים וזמן רב, עם הזמינות של רקמה מוגבלת ובעיקר ממקור לא אנושי. פרוטוקולים אחרים מאפשרים שליטה רבה יותר על הסביבה התאית נוצרה כגון nanoimprinting, בתצהיר ECM, טכנולוגיות וכו 'תא, או electrospinning. Electrospinning יוצר מחצלות ארוגים 3D נקבוביות של סיבים בקטרים הנעים בין ננומטר למיקרומטר, replicating ממדי ECM טבעיים. פיגומי electrospun יותר ויותר להיות מועסקים כפלטפורמות culturing תא 3D -. מניפולציה של הפרמטרים electrospinning מאפשרת שליטה מורכבת על מאפייני פיגום כגון גודל נקבובית, בקוטר סיבים, טופוגרפיה ויישור, וכימיה של פני השטח. שינויים של פרמטרים כגון הוכחו להשפיע הידבקות תא וצמיחה ישירות, כאשר תאים בתרבית בבידוד.
יתרונות אלה נוצלו במחקר הנוכחי כדי לאפשר culturing של סוגי תאים מרובים כמבנה רקמת 3D יחיד, באמצעות bronchiole בדרכי הנשימה כמבנה רקמת מודל 3D. קיר bronchiole מורכב משלושה אזורים עיקריים (איור 1). הרירית שבו תאי האפיתל בדרכי נשימה לשבת בממשק האוויר הנוזלי (עלי), ומספקים מחסום חשוב לסביבה החיצונית. הם מתגוררים בקרום במרתף רשתי (RBM), ECM בחוזקה קומפקטי כולל בעיקר collagen IV, perlecans, וlaminins. השכבה תת-ריריים נמצאת ישירות מתחת לרירית, אזור נקבובי יותר מורכב מסוגי תאים רבים, כולל fibroblasts, myofibroblasts וחדירה לויקוציטים בתנאי מחלה. לבסוף חבילות שריר החלק לעטוף את דרכי הנשימה בצורה סליל, והם מורכבים מגיליונות מיושרים של שרירים בדרכי נשימה חלקים (ASM). זה מצב ההתכווצות היחסי של שריר החלק ששולט טון בדרכי נשימה. התעסוקה של פיגומי electrospun במערכת הריאות שעד לאחרונה הייתה מוגבלת למטרות משובי; עם החלפת קנה הנשימה electrospun שהושתלה בהצלחה. בעוד מוצלח, טיפולים כאלה הם מוגבלים במספרים, והם התמקדו בקנה הנשימה בשל האופי הפשוט היחסי של הפונקציה של הרקמות. דוגמאות מוגבלת של דגמים בדרכי נשימה המשמשים לאבחון במבחנה קיימות, ומתמקדות בעיקר במדידות התכווצות שריר חלק,. לא רעיל ולאterephthalate פוליאתילן פולימר n-מתכלה (PET) כבר בעבר electrospun, והועסק במחקר הנוכחי על מנת להבטיח פיגומים מיוצרים יכול להיות מאוחסן במשך תקופות ארוכות ללא משפיל (ומאפשר להם לשמש "מהמדף"), וגם להיות מתאים לתרבית תאים יציבה על פני תקופות זמן ממושכות. מחקרים קודמים מהקבוצה שלנו הראו כי העסקת שלוש וריאציות של פרוטוקול electrospinning בסיסי, ניתן לייצר שלושה פיגומי electrospun PET פרט לספק טופוגרפיות אופטימליות לאפיתל דרכי הנשימה culturing, פיברובלסטים, ותאי שריר חלק בבידוד 21,22 וcoculture של דרכי הנשימה תאי האפיתל ופיברובלסטים 22. קוטר סיבים נמצא משפיע על הפונקציונליות אפיתל 22 מאוד, ויישור סיבים אפשר הדור של גיליונות מיושרים של שריר חלק 21. מחקרים אלו בוצעו באופן בלתי תלוי זה בזה בתנאים סטטיים. במחקר הנוכחי, differe אלהפיגומי NT, המכילים תאי אדם בוגרים מובחן באופן מלא כבר cocultured במשך שבוע אחד בALI בbioreactor זמין מסחרי כסעיף 3 ד לקיר בדרכי הנשימה, מתן מבחינה פיזיולוגית רלוונטי במודל מבחנה לחקור תגובות בין-תאיות בדרכי נשימה. בעוד פרוטוקול זה הוא באמצעות bronchiole בדרכי הנשימה כמערכת מודל, זה יכול להיות מותאם כפלטפורמה לcoculture 3D של יחידות הריריות מאיברים אחרים.
יכולת electrospin סיבים פולימריים עם תכונות מבניות דומות לECM הטבעי הובילה לפולימרים רבים טבעיים או סינטטיים, או תערובות פולימר להיות electrospun לשחזר סביבות אלה,. מניפולציה של הפרמטרים התהליך (כולל בחירת פולימר, ריכוז פולימר,, מרחק קצה מחט ממס וטמפרטורה) יכול כל מאפייני פיגום ההשפעה; עם זאת כמה פרמטרים יכולים להיות השפעה גדולה יותר על מאפייני פיגום מאחרים 25,. כאשר שינוי קוטר סיבי PET, מצאנו את הפרמטרים המרכזיים להיות הריכוז של הפולימרים המשמש, בקצב שבי פתרון הפולימר היה electrospun, והקוטר של המחט. כאשר electrospinning סיבים מיושרים הפרמטרים המרכזיים הם שיטת הגבייה בשימוש (mandrel מסתובב), והמהירות שבה מסתובב mandrel. באמצעות הפחתת מהירות mandrel 60 סל"ד, שמצאנו את הפיגומים מיושרים באופן אקראי מיוצרים הראו חד פיגום גדול יותרformity לעומת electrospinning על צלחת שטוחה אספן.
המאפיינים של רקמה בדרכי הנשימה decellularized נותחו לספק הדרכה לטופוגרפיות פיגום השונות שפותחו לתרבות של כל תא מסוג של דרכי הנשימה. nanofibers electrospun הוא פיגום אטרקטיבי לשכפל מבני קרום במרתף בשל הגודל הקטן הנקבובית אך הנקבוביות כולל גבוהה המאפשר לדיפוזיה המטבוליט מוגברת תוך הגבלת תנועה סלולרית. 9 בעוד אופטימיזציה של פרמטרי electrospinning, טווח ריכוזים וספיקות PET נבדק. הסיבים הדקים ביותר הושגו באמצעות פתרון WT / PET כרך 6%, ששמש בעבר על ידי קבוצות אחרות. עם זאת, רמות גבוהות של חרוזים, וחוסר האחידות היו בעיות קבועות. ניסיונות ראשוניים להסיר את האגלים כללו הוספת שטח קטיוני, ברומיד cetyltrimethylammonium (CTAB), לפתרון להוריד את מתח הפנים, ובדיקת מקורות שוניםשל PET. התוספת של שטח הפחיתה את כמות חרוזים, אך לא באופן מלא. לאחר שניסיתי מספר המקורות מסחריים של כדורי PET, בקבוק משקה כיתה מזון לחיות מחמד היה בשימוש, על ידי חיתוך את בקבוקי משקאות והמסה אלה בDCM: פתרון ממס TFA. שימוש זה כמקור PET הביא לגידול באחידות סיבים וירידה באגלי סיבים. על ידי הגדלת ריכוז הפתרון מעט ל -8% WT / כרך וצמצום קוטר המחט (18G ל23G) שהפקנו באופן עקבי nanofibers פגם חופשי בקוטר סיבים של כ 250 ננומטר. פיגומי nanofiber electrospun יכולים להיות אלקטרוסטטי מאוד על גבייה מmandrel ביצוע טיפול ידני של הפיגומים קשים. זה היה שיפור על ידי אחסון הפיגומים בנייר אלומיניום אחרי ספינינג והשרייה ב- 70% IMS לפני השימוש. זה הופיע כדי לעזור להפיג את המטען אלקטרוסטטי השייר השאיר על הפיגום מתהליך electrospinning.
לספק עליוןographies דומה למייקרו-הסביבות הבודדים שנתקלה בם שלושה סוגי תאים בדרכי נשימה עיקריים בתוך הקיר בדרכי הנשימה, פרוטוקול electrospinning בסיסי הותאם לייצר שלושה פיגומים ייחודיים לסוגי התאים: על ידי electrospinning פתרון PET הריכוז נמוך לאט, nanofibers מיושר באופן אקראי נוצרו, על שתאי האפיתל היו זרע (מחקה את RBM). על ידי electrospinning פתרון PET ריכוז גבוה יותר בקצב מהיר יותר, microfibers מיושר באופן אקראי נוצרו (הפקת פיגום נקבובי יותר), שאליו fibroblasts היה זרע (מחקה את האזור תת-ריריים מייד מתחת לRBM). על ידי electrospinning פתרון PET הריכוז נמוך על מהירות גבוהה מסתובבת nanofibers mandrel מיושר הופקו, על שתאי שריר חלק חוקיים בכיוון הסיבים, הפקה מיושרות גיליונות של תאים.
קטרי סיבים הגדילו את יתרון לגודל נקבובית מוגבר, המאפשרים penetratio תא גדול יותרn לפיגומים וכך לסייע ביצירת סביבת 3D אמיתית,. פיגומי מיקרופייבר הועסקו לתרבות של fibroblasts במחקר על מנת להבטיח שהתאים התגוררו במטוסים מרובים בתוך הפיגום. על ידי הגדלת ריכוז PET 30% WT / כרך, סיבי PET עם קוטר ממוצע של 2.5 מיקרומטר הופקו. סיבים בקוטר גדול יותר (4 ≈ מיקרומטר) הופקו באמצעות 35% פתרון PET WT / כרך, אבל אחידות עובי הפיגום אבדה, ושונות גבוהות בין סיבים הבודדים היו ברורות. נקבוביות בפיגום מיקרופייבר היו מעל 7 פעמים יותר מאלה שנמדדו בפיגומי nanofiber (10.45 מיקרומטר לעומת 1.43 מיקרומטר בהתאמה), אך זריעה עדיין סטטי של תאים סיפקה חדירה סלולרית מוגבלת. זה השתפר באופן דינמי זריעת התאים באמצעות מיקסר מסלולית, שיטה הוכיחה את היעילות בעבר.
פיגומי nanofiber מיושרים מאוד נוצרו על ידי electrospinning 10%WT / פתרון PET כרך על mandrel מסתובב בסל"ד 2000 (440 מ '≈ · דקות -1). ריכוז PET הוגדל מ 8% כדי למנוע מורפולוגיה כמו גל-סדירה שסיבים הוצגו בריכוזים נמוכים יותר. למרות העלייה בריכוז, יישור הסיבים הקטין את הקוטר הממוצע סיבים (ננומטר לעומת 255 216 ננומטר, מיושר מול אקראי). המהירות הגבוהה של mandrel ציור הסיבים החוצה לפני שהם התייבשו עלולה לגרום לאפקט הזה. היישור של הסיבים השפיע על היישור של תאי ASM, ויש גם השפעות פיסיולוגיות אחרות על תאי ASM אשר מתאפיינים במקום אחר 21.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא חוסר יכולת תאי חיים תמונה / בפיגומים עושים תא-עיקול או בידול ראשוני על פרק זמן ממושך ניתן לקבוע מבלי להקריב דגימות. משמעות הדבר הכי אופטימיזציה מתרחשת לאחר תקופת התרבות, כלומר, לתקןing דגימות ולאחר מכן מדידה אם תרבית תאים הייתה מוצלחת לאחר שלא במהלך תרבית תאים. התבוננות שינוי צבע בפיגומים מודגרות בalamarBlue (כחול לורוד) מצביעה על תאים בהווה ובבת קיימא, אבל לא אידיאלי. פולימרים שקופים יותר electrospinning כגון ג'לטין יכולים לסייע בחזותיים תאים על הפיגומים. Electrospinning של פיגום nanofibrous בתוך המודל שלנו אפשר את השכפול של RBM בדרכי הנשימה, באופן דומה המורכב מnanofibers הצפוף שבו תאי האפיתל מתגוררים. זה בעבר הוכח כי תאים מבניים לא יכולים להעביר דרך פיגום nanofiber 22, למרות שתאי מערכת חיסון יכולים (מידע לא מוצג). בעוד יתרון עבור culturing של תא-סוגים ספציפיים על משטח 3D (כגון אפיתל ותאי האנדותל), מניעת נדידת תאים מבנית זו דרך nanofibers עלולה להיות מזיקים לתרבית של סוגי תאים אחרים. כשריר חלק אינו יכול להעביר דרך הפיגום nanofiber דואר מיושר התאספנו coculture תלת-שכבתי עם שריר החלק ושכבות פיברובלסטים זה מול זה (בניגוד לפיגום מיושר המפריד בין שני סוגי התאים). אמנם זה מאפשר לתאים להיות הפרד קרוב, המחקר הנוכחי לא יכול להסיק אם סוג אחד של תאים (או פיברובלסטים או שריר חלק) היה לעקוף את כל השכבה על פני תקופה ממושכת יותר תרבות. למרות מגבלות אלה, מודל תלת-שכבת קיימא של הקיר בדרכי הנשימה פותח המספקת פלטפורמה חלופית לחקור את יחסי הגומלין בין תאים אלו סוגים מרובים. לאחרונה פורסם מחקר תלת-שכבתי דומה בי fibroblasts היו מוטבע בתוך קולגן גלילי אני הידרוג'ל עם שריר חלק זורעים על פני השטח החיצוניים ותאי האפיתל בשטח luminal 17. היציבות המכנית של פיגומי electrospun פיתחו כאן יאפשר צינור דומה בונה להיווצר, ונשארה resea נוכחיRCH שואף בקבוצה שלנו. בעוד המחקר התמקד בדרכי הנשימה, כמה איברים בגוף הנתח יחידה מבנית ברירית בסיסית זה, ובאמצעות שינוי הדיירים מודגשים במחקר זה, פלטפורמות דומות ניתן לפתח עבור רקמות המכילות יחידת קרום במרתף כוללים כלי דם, שלפוחית השתן ו הקרנית, שבו דגמים רב שכבתיים המבוססים קולגן להיות מועסקים.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |