נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Decellularization וrecellularization עשוי לאפשר את הדור של איברים פונקציונליים, השתלה במבחנה 1. על ידי תאי הסרת וחומר אנטיגני (למשל., DNA, epitopes אלפא-גל) מאיבר, ניתן להשיג את המטריצה הלא פחות או-חיסונית תאית (ECM). מטריצה זו חוסכת microanatomy תלת ממדי של איברים ויכולה לשמש כbiomatrix האידיאלי לאכלוס עם תאים ממוצא שונה, ואולי xenogeneic 2. כך, מטריצת כבד חולדה decellularized יכולה להיות אוכלס מחדש עם תאי כבד אנושיים. מיקרו-כבד אנושי זה יכול לשמש כמודל vivo לשעבר למחקר על מחלות (למשל., מחלות מטבוליות מולדות, מחלות ויראליות או ממאירות) או לבדיקת תרופות פרה 3.
כמה פרוטוקולים שונים לdecellularization זלוף כבד חולדה כבר פורסמו 4-13. בכל הפרוטוקולים, decellularלמען האזרוח הושג על ידי טפטוף של חומרי ניקוי יוניים או שאינם יוניים בסיסיים דרך וריד פורטל cannulated. למיטב ידיעתנו, היינו הקבוצה הראשונה לדווח decellularization כבד חולדה על ידי זלוף סלקטיבית דרך וריד הפורטל ו / או עכברוש העורק כבד 14. מאפשר זלוף סלקטיבית של מערכות כלי דם השונות בכבד עשוי לאפשר תוצאות decellularization טובות יותר ו, יתר על כן, עשוי לשחק תפקיד חשוב באכלוס סלולארי.
במחקר המפורט כאן, כבדים היו perfused במכשיר זלוף קניינית מותאם אישית, המאפשרים זלוף בתנאי לחץ נדנוד. תנאי לחץ אלה מחקים את זלוף נשימה תלויה הפיזיולוגי של הכבד: באתר, הכבד נתקע מתחת לאוגד של הסרעפת, תנועה שבנשימה יש השפעה ישירה על זלוף כבד. השראה במיוחד מובילה להורדת של הסרעפת ולסחוט של הכבד, אופטימיזציהיצוא hepato-ורידים, ואילו פקיעה מובילה להעלאה של הכבד והורדה של לחץ intraabdominal כדי לייעל יבוא פורטל-ורידים 15.
המטרה שלנו הייתה להעריך אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על ההומוגניות של decellularization זלוף כבד חולדה על ידי חיקוי תנאי intraabdominal vivo לשעבר. ההומוגניות של תהליך decellularization עשויה להיות גורם לזלזל בdecellularization זלוף. כל הסוכנים הידועים המשמשים לשינויי סיבת decellularization הכבד לECM. תאים באזורי perfused גרוע יישארו בECM, ואילו באזורים אחרים כבר decellularized לחלוטין. לפזר את התאים הנותרים, משך זלוף או לחץ חייב להיות מורם, גורם ליותר שינויים באזורי perfused היטב. לפיכך, חומרי ניקוי לdecellularization צריך להיות מופץ homogenously בתוך האיבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שהטכניקה שהוצגה לקציר כבד החולדה וdecellularization היא לשחזור בקלות, ישנם צעדים קריטיים מסוימים לשקול:
במהלך הכנה לקציר כבד, חשוב להימנע מדימום חמור משום שהיא תפעיל קרישת דם ועלולה לגרום להיווצרות קריש דם בתוך הכבד. לדעתנו, זה יתר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
References
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
- De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
- Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
- Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
- Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
