Порядок Decellularization из печени крыс в перфузии устройство Качающийся давления
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Decellularization и recellularization может позволить поколение функциональных, трансплантации органов в пробирке 1. Путем удаления клеток и антигенного материала (например., ДНК, альфа-гал эпитопы) из органа, не- или менее иммуногенной внеклеточного матрикса (ЕСМ) может быть получена. Эта матрица сохраняет трехмерное микроанатомии органа и может служить в качестве идеального биоматрицы для заселения с клетками другом, возможно, ксеногенной происхождения 2. Таким образом, decellularized крысы матрица печени может быть заселен клетками печени человека. Это гуманизированный микро-печени может служить экс естественных условиях модели для исследования на заболевания (например, врожденные., Метаболические заболевания, вирусные заболевания или злокачественные новообразования) или для доклинических испытаний фармацевтической 3.
Несколько различных протоколов для перфузии печени крыс decellularization уже были опубликованы 4-13. Во всех протоколов, decellularлизации была достигнута путем перфузии щелочных ионных или неионных детергентов через канюлированную воротную вену. Для нашим сведениям, мы были первой группой, чтобы сообщить крыс decellularization печени путем селективного перфузии через портальную вену и / или печеночной артерии крысы 14. Включение селективного перфузию различных сосудистых систем в печени может позволить лучшие результаты decellularization и, кроме того, могут играть важную роль в клеточном репопуляции.
В исследовании подробно здесь, печень перфузии в заказ фирменной перфузии устройства, что позволяет перфузии при колеблющихся условиях давления. Эти условия давления имитировать физиологическую дыхательных-зависимую перфузии печени: в месте, печени висит под связки диафрагмы, чьи движения при дыхании имеет прямое влияние на перфузии печени. Вдохновение, специально приводит к снижению диафрагмы и сжимая печени, оптимизациигепато-венозный отток, в то время истечения приводит к высоте в печени и снижение внутрибрюшного давления, чтобы оптимизировать портального венозного притока 15.
Наша цель в том, чтобы оценить, насколько условия колеблющиеся давления имеют влияние на однородность перфузии печени крыс decellularization имитируя условия внутрибрюшного бывших естественных условиях. Однородность процесса decellularization может быть недооценена фактором перфузии decellularization. Все известные вещества, используемые для decellularization печени вызывают изменения в ECM. Клетки плохо перфузированных районах по-прежнему в ECM, в то время как другие области уже полностью decellularized. Чтобы растворить остальные клетки, продолжительность перфузии или давление должно быть повышенным, в результате чего несколько изменений в хорошо увлажненную областей. Таким образом, моющие средства для decellularization должны быть распределены равномерно внутри органа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя представлены техника для уборки печени крысы и decellularization легко воспроизводимым, есть определенные критические шаги, чтобы рассмотреть:
В ходе подготовки к заготовке печени, важно, чтобы избежать кровотечение, потому что он активирует свертывание крови и может прив…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
References
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
- De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
- Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
- Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
- Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
