Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Met behulp van flowcytometrie

Summary

Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.

Abstract

Microbiële subpopulaties in veld en laboratoriumstudies bleek een hoge heterogeniteit in morfologische en fysiologische parameters weergegeven. Het bepalen van de actuele toestand van een microbiële cel overstijgt levende of dode categorieën, zoals microben kan voorkomen in een slapende toestand, waarbij celdeling en metabolische activiteiten verminderd. Gezien de noodzaak voor detectie en kwantificering van microben flowcytometrie (FCM) met moleculaire probes verschaft een snelle en nauwkeurige methode om te bepalen algemene levensvatbaarheid populatie. Door het gebruik van SYTOX Groen en SYTOX Oranje in het model cyanobacterie Microcystis aeruginosa te membraanintegriteit ontdekken, ontwikkelen we een overdraagbare methode voor een snelle indicatie van enkele cel sterfte. De moleculaire probes die in dit tijdschrift worden genoemd groen of oranje nucleïnezuur probes respectievelijk (hoewel er andere producten met gelijke excitatie en emissie golflengten die vergelijkbare functies hebben action, we specifiek naar de voorgrond genoemde sondes). Protocollen met behulp van moleculaire probes verschillen tussen soorten verschillen voornamelijk in concentratie en incubatietijd. Na dit protocol beschreven op M.aeruginosa de groene nucleïnezuurprobe geoptimaliseerd in concentraties van 0,5 uM na 30 min incuberen en de oranje nucleïnezuurprobe bij 1 uM na 10 min. In beide sondes concentraties lager dan hier vermeld geleid tot onder rapportage van cellen met membraanschade. Omgekeerd 5 uM concentraties en hoger in beide probes vertoonden een type niet-specifieke kleuring, waarbij 'levende' cellen die een doel fluorescentie, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van "niet-levensvatbaar" celaantallen. De positieve controles (warmte gedode) die toetsbaar dode biomassa, hoewel de geschiktheid van controle generatie blijft onderwerp van discussie. Door het aantonen van een logische opeenvolging van stappen voor het optimaliseren van de groene en oranje nucleïnezuurprobes we demonstrate hoe een protocol dat kan worden gebruikt voor cyanobacteriën fysiologische toestand effectief te analyseren creëren.

Introduction

De cel is een complex systeem dat continu reageert op het milieu door beïnvloeding van de fysiologische parameters en de functie ervan te veranderen. De populatie dynamica van isogene microbiële populaties zowel qua aard als het laboratorium worden beïnvloed door de ontwikkeling van subpopulaties, optredende zelfs onder betrekkelijk constante milieuomstandigheden ^{1 – 3.} De variabiliteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen ontstaat als gevolg van de sterk variabele aard van omgevingsomstandigheden. Deze soms stochastische processen vervolgens produceren subpopulaties die zijn heel anders dan de gemiddelde bevolking. Recent bewijs is gebleken dat deze fysiologische subpopulaties verschillend reageren op milieu-omstandigheden en kan het signaal verbindingen of remmers die drastisch beïnvloeden en invloed hebben op de totale ^3,4 bevolking te produceren.

De oprichting van een methode om heterogeniteit binnen een populatie te definiëren is de sleutel tot understanding de ecologie van microben in verschillende omgevingen en is essentieel bij het ​​bouwen kennis overlast cyanobacteriën, zoals toxische Microcystis, die grote gevolgen hebben voor de menselijke waterzekerheid. Soorten zoals Anabaena morfologische heterogeniteit weergegeven in reactie op omgevingschommelingen ontwikkelen gespecialiseerde cellen zoals heterocysten en akinetes ^2. In tegenstelling, doe Microcystis cellen niet duidelijk morfologische heterogeniteit tonen tijdens een reactie op stress. Het onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen is het belangrijkste fysiologische differentiatie en maakt een beter begrip van microbiële populatie. Echter, de conceptuele probleem van de bacteriële levensvatbaarheid zelf blijft moeilijk en slecht gekenmerkt ^1,5,6.

Flowcytometrie (FCM) is een betrouwbare en snelle werkwijze voor het analyseren van afzonderlijke cellen. Om het begrip van enkele cel fysio verhogenlogie met FCM, zijn moleculaire probes werden gebruikt voor een aantal metabolische en biochemische processen ⁷ onderscheiden. Dit heeft geleid tot een grotere kennis van de soorten op cellulair en populatieniveau en op zijn beurt hielp waterbeheer ^8,9. Echter organismen verschillen in moleculaire opname en efflux probe vanwege de poriën en pompen in celwanden en membranen, die hebben geleid tot een aantal moleculaire ontwerp probe en protocolimplementatie ^6,10,11. Moleculaire probes beschikbaar voor commerciële en onderzoeksdoeleinden worden vaak voorzien van een generiek protocol die van toepassing kunnen zijn voor een heel ander celtype. Men moet zeer voorzichtig overdracht protocollen ontwikkeld één celtype tot een ander ^6, is het daarom een essentiële taak moleculaire probes optimaal effectief voor gebruik.

De groene en oranje nucleïnezuur probes binden aan zowel dubbel- en enkelstrengs nucleïnezuren met minimale base selecterentiviteit en worden gebruikt om de plasma membraan integriteit van de cellen te beoordelen. De groene nucleïnezuur probe een duidelijk verbeterde cel labeling fluorescentiesignaal vergeleken met andere moleculaire probes, zoals propidium-jodide gebaseerde verbindingen ^12, die ook kan fungeren als een indicator van de levensvatbaarheid van de cellen. De term "cell rentabiliteit" Hier neemt aan dat DNA degradatie optreedt na het verlies van plasmamembraan integriteit. De nucleïnezuurprobes zijn asymmetrisch cyaninekleurstoffen met drie positieve ladingen en kan niet cellen met intacte membranen te voeren onder gekenmerkt concentraties in zowel eukaryotische ^11,13 en ^14,15 prokaryotische organismen. De binding van een nucleïnezuur probe nucleïnezuren kunnen leiden tot een> 500-voudige toename van fluorescentie-emissie van endogene signalen in cellen die hun membraan integriteit aangetast. Hoewel moleculaire probes zoals de groene nucleïnezuurprobe een goede indicator van de enkelvoudige celfysiologie kan zijn, is er behoefte to optimaliseren elke sonde met het beoogde doel organisme, zoals incubatietijd hebben varieerden van 7 min – 30 min en concentratie varieert van 0,1 uM – 0,5 micrometer in Microcystis experimenten alleen ^15-19.

Hier presenteren we een protocol om de cytometrische analyses van groen en de relatief nieuwe oranje nucleïnezuurprobes (die tot op heden niet getest op de cyanobacteriën soort M.aeruginosa) te optimaliseren. De volgende ontwikkelde methodologie kan worden overgedragen naar andere soorten en gebruikt als een platform voor het optimaliseren van protocollen in andere moleculaire probes, waardoor het begrip van microben en ecologische gedrag verhogen.

Protocol

1. Bereiding van de Molecular Probe en Flow Cytometer Verdunde voorraadoplossingen van de nucleïnezuur probes, die worden geleverd als een 5 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) tot hoeveelheden van gewenste concentraties in ultrazuiver gefiltreerd H 2 O. Bewaar de nucleïnezuur probes in het donker tussen -5 ° C en – 25 ° C tot gebruik. Schakel de flowcytometer en de belasting softwarepakket (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor FCM specificat…

Representative Results

Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) en kant lichtverstrooiing (SSC) uitgangen van een M.aeruginosa batch cultuur in exponentiële fase geeft informatie over de grootte cel (diameter) en de interne granulariteit respectievelijk (Figuur 1A). FSC kunnen cellen die te groot en / of klein M.aeruginosa te onderscheiden zijn. Deze discriminatie of gating kan door raffinage van gegevens tussen bepaalde punten van FSC uitgang (figuur 1C). Phycoc…

Discussion

Het toegenomen aantal publicaties behulp van moleculaire probes aangeeft dat betrouwbare en informatieve gegevens kunnen worden verkregen ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Tot nu toe is er geen perfecte vlek voor de levensvatbaarheid van de cellen die effectief kan zijn in alle soorten met dezelfde concentratie en incubatietijd ^6,10. Zelfs hetzelfde type probe met gewijzigde fluorescentie-emissie blijkt het nodig de juiste concentratie en incubatietijd (tabellen 1 en 3) va…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO