Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Usando citometría de flujo

Summary

Las poblaciones microbianas contienen heterogeneidad celular sustancial, que puede dictar el comportamiento general. Análisis de la sonda molecular a través de citometría de flujo puede determinar estados fisiológicos de las células, sin embargo su aplicación varía entre las especies. Este estudio proporciona un protocolo para determinar con precisión la mortalidad celular dentro de una población cianobacteria, sin menospreciar o grabación de resultados falsos positivos.

Abstract

Subpoblaciones microbianos en los estudios de campo y de laboratorio se ha demostrado que mostrar una alta heterogeneidad en los parámetros morfológicos y fisiológicos. Determinar el estado en tiempo real de una célula microbiana va más allá de las categorías vivos o muertos, como los microbios pueden existir en un estado latente, en el que la división celular y las actividades metabólicas se reducen. Teniendo en cuenta la necesidad de detección y cuantificación de los microbios, citometría de flujo (FCM) con sondas moleculares proporciona un método rápido y preciso para ayudar a determinar la viabilidad global de la población. Mediante el uso de SYTOX verde y SYTOX naranja en el modelo de cianobacterias Microcystis aeruginosa para detectar la integridad de membrana, desarrollamos un método transferible para la indicación rápida de la mortalidad de células individuales. Las sondas moleculares utilizados en esta revista se hará referencia a sondas de ácido nucleico como verde o naranja, respectivamente (aunque hay otros productos con longitudes de onda de excitación y emisión similares que tienen unos modos comparables de action, nos referimos específicamente a la palestra mencionó sondas). Protocolos utilizando sondas moleculares varían entre especies, que difieren principalmente en la concentración y el tiempo de incubación. Siguiendo este protocolo establecido en M. aeruginosa la sonda de ácido nucleico verde se optimizó en concentraciones de 0,5 M después de 30 minutos de incubación y la sonda de ácido nucleico naranja en 1 M después de 10 min. En ambas sondas concentraciones inferiores a la óptima indicado conducido a un bajo notificación de células con daño de la membrana. Por el contrario, 5 M concentraciones y superior en ambas sondas mostraron un tipo de tinción no específica, mediante el cual las células 'en vivo' producen una fluorescencia de destino, lo que lleva a una representación más del número de células "no viables". Los controles positivos (con el calor mató), siempre biomasa muerta comprobable, aunque la adecuación de la generación de control sigue siendo objeto de debate. Al demostrar una secuencia lógica de pasos para la optimización de las sondas de ácido nucleico verde y naranja de nosotrosmonstrate cómo crear un protocolo que se puede utilizar para analizar el estado fisiológico de cianobacterias con eficacia.

Introduction

La célula es un sistema complejo, que responde constantemente con el medio ambiente mediante la modificación de parámetros fisiológicos y alterar su función. La dinámica poblacional de las poblaciones microbianas isogénicas tanto en la naturaleza y el laboratorio se ven afectados por el desarrollo de las subpoblaciones, ocurriendo incluso en relativamente constantes las condiciones ambientales ^{1 – 3.} La variabilidad de las comunidades microbianas naturales surge debido a la naturaleza altamente variable de condiciones ambientales. Estos procesos estocásticos veces posteriormente producen subpoblaciones que son muy diferentes a la media de la población. La evidencia reciente ha revelado que estas subpoblaciones fisiológicos responden de manera diferente a las condiciones ambientales y pueden producir compuestos de señal o inhibidores que afectan e influyen en el ^3,4 de la población general de forma espectacular.

El establecimiento de un método para definir la heterogeneidad dentro de una población es clave para la ONUcomprensión de la ecología de microbios en distintos ambientes y es esencial en la construcción de conocimiento de cianobacterias molestia, como la Microcystis tóxico, lo que afecta en gran medida de la seguridad del agua humana. Especies como Anabaena mostrar la heterogeneidad morfológica en respuesta a las fluctuaciones ambientales, el desarrollo de las células especializadas como heterocistos y acinetas ^2. En contraste, las células Microcystis no se muestran heterogeneidad morfológica evidente durante una respuesta de estrés. La discriminación entre células viables y no viables es el aspecto más importante de la diferenciación fisiológica y permite una mejor comprensión de la dinámica de la población microbiana. Sin embargo, el problema conceptual de la viabilidad bacteriana en sí sigue siendo difícil y mal caracterizado ^1,5,6.

La citometría de flujo (FCM) es un método fiable y rápida de analizar las células individuales. Para aumentar la comprensión de la única fisio celularlogía a través de FCM, sondas moleculares se han utilizado para distinguir una serie de procesos metabólicos y bioquímicos ^7. Esto ha llevado a un mayor conocimiento de las especies a nivel celular y la población y, a su vez ayudó a la gestión de los recursos hídricos ^8,9. Sin embargo, los organismos difieren en cuanto a la captación de la sonda molecular y flujo de salida debido a los poros y las bombas en las paredes celulares y membranas, que han conducido a una serie de diseño de la sonda molecular y la aplicación del protocolo ^6,10,11. Sondas moleculares disponibles para propósitos comerciales y de investigación se suministran a menudo con un protocolo genérico que puede ser aplicable a un tipo de célula muy diferente. Hay que ser muy prudente en la transferencia de los protocolos desarrollados para un tipo de célula a otro ^6, por lo tanto, es una tarea esencial para optimizar sondas moleculares con eficacia antes de su uso.

Las sondas de ácido nucleico verde y naranja se unen a los dos ácidos nucleicos de cadena dobles e individuales con la base mínima seleccioneivity y se utilizan para evaluar la integridad de la membrana plasmática de las células. La sonda de ácido nucleico verde tiene una señal de fluorescencia etiquetado celular notablemente mejorado en comparación con otras sondas moleculares, tales como compuestos a base de yoduro de propidio ^{12, que} también puede actuar como un indicador de la viabilidad celular. El término "viabilidad celular 'aquí presupone que la degradación del ADN se produce después de la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Las sondas de ácidos nucleicos son tintes de cianina asimétrica con tres cargas positivas y no pueden entrar en las células con membranas intactas bajo concentraciones caracterizadas, en ambas eucariotas y procariotas ^{14,15 11,13} organismos. La unión de una sonda de ácido nucleico a los ácidos nucleicos puede resultar en un aumento de hasta tapa> 500 de emisiones de fluorescencia a partir de señales endógenas en las células que tienen su integridad de la membrana comprometida. Aunque sondas moleculares, tales como la sonda de ácido nucleico verde puede ser un buen indicador de la fisiología de células individuales, hay una necesidad de to optimizar cada sonda con el organismo objetivo pretendido, como los tiempos de incubación han variado de 7 min – 30 min y rangos de concentración de 0,1 M – 0,5 M en experimentos Microcystis solo ^{15 – 19.}

Aquí se presenta un protocolo para optimizar los ensayos de citometría de verde y las relativamente nuevas sondas de ácidos nucleicos naranja (que hasta la fecha no ha probado en las especies de cianobacterias M. aeruginosa). La siguiente metodología desarrollada puede entonces ser transferido a otras especies y se utiliza como una plataforma para la optimización de protocolos en otras sondas moleculares, aumentando con ello la comprensión de los microbios y su comportamiento ecológico.

Protocol

1. Preparación de la sonda Molecular y citómetro de flujo Diluir las soluciones madre de las sondas de ácido nucleico, que se suministran en forma de solución 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) a alícuotas de las concentraciones requeridas en ultrapura filtrada H2O Guarde las sondas de ácido nucleico en condiciones de oscuridad entre -5 ° C y – 25 ° C hasta su uso. Encienda el citómetro de flujo y el paquete de software de carga (ver tabla de Materia…

Representative Results

Dispersión frontal de luz (FSC) y salidas de luz lateral de dispersión (SSC) a partir de un cultivo discontinuo M. aeruginosa en fase exponencial proporciona información sobre el tamaño celular (diámetro) y granularidad interna, respectivamente (Figura 1). FSC puede discriminar las células que son demasiado grandes y / o pequeños para ser M. aeruginosa. Esta discriminación o compuerta se puede hacer mediante los datos de refinación entre determ…

Discussion

El aumento del número de publicaciones utilizando sondas moleculares indican que los datos fiables e informativas se pueden obtener ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Hasta el momento no hay ninguna mancha perfecta para la viabilidad celular que puede ser eficaz en todas las especies con la misma concentración y tiempo de incubación ^6,10. Incluso el mismo tipo de sonda con emisiones de fluorescencia alteradas muestra una necesidad de establecer la concentración y tiempo de incubación c…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO