Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO<sub> 2</sub> Photokatalyse
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
Organische Verunreinigungen auf der Oberfläche eines Titandioxid (TiO 2), adsorbiert durch Photokatalyse unter ultraviolettem Licht (UV) zerlegt werden. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll unter Verwendung des TiO 2 Photokatalyse zur Zellaffinität der Substratoberfläche lokal zu verändern. Für dieses Experiment wurde eine dünne TiO 2 -Schicht wurde durch Sputtern beschichtet auf einem Deckglas, und die TiO 2 -Oberfläche wurde anschließend mit einem Organosilan Monoschicht aus Octadecyltrichlorsilan (OTS) ableitet, die die Zelladhäsion hemmt modifiziert. Die Probe wurde in einem Zellkulturmedium eingetaucht ist, und konzentrierte UV-Licht wurde auf einem achteckigen Bereich bestrahlt. Wenn eine neuronale Zelllinie PC12-Zellen wurden auf der Probe überzogen, Zellen, die nur auf die UV-bestrahlte Fläche haftet. Wir zeigen weiter, daß diese Oberflächenmodifikation kann auch in situ erfolgen, das heißt, auch wenn die Zellen auf dem Substrat wächst. Korrekte Modifikation der Oberfläche benötigt eine extrazelluläre Matrix protein Kollagen in dem Medium zum Zeitpunkt der UV-Bestrahlung vorliegen. Die hier vorgestellte Methode kann potenziell in Strukturierung mehrere Zelltypen für den Bau von Co-Kultur-Systeme oder willkürlich zu manipulieren Zellen unter Kultur eingesetzt werden.
Introduction
Halbleiter-Lithographieverfahren und seine Derivate – wie Photolithographie 1,2, Elektronenstrahllithographie 3-6 und 7-10 Mikrokontaktdruck – sind mittlerweile ein etabliertes Werkzeug in der Zellbiologie, lebende Zellen in einer definierten Position und Geometrie wachsen. Die Musterungsverfahren beruht auf der Verwendung von mikro Substrate, bestehend aus Mikro-Insel Zelle permissive Beschichtung in einem nicht-permissiven Hintergrund. Ein solches Substrat dient als Vorlage, um Muster der Zellen. Diese Technologien haben uns zur Verfügung gestellt, die die neuen Methoden, um Zellen und ihre Funktion Ingenieur bei einem Ein- und Mehrzellebene, um die inhärenten Eigenschaften von Zellen zu extrahieren, und um den Durchsatz von zellbasierten Wirkstoff-Screening-11 zu erhöhen.
Der Grad Freiheits in Zellmusterungs würde erheblich zunehmen, wenn die Schablonenmustergeometrie in situ verändert werden, das heißt, während die Zellen auf den n kultivierturface. Die herkömmlichen Verfahren zur Musterbildung kann hier nicht direkt angewendet werden, da sie Verfahrensproben in der Atmosphäre oder im Vakuum. Deshalb werden verschiedene neue Oberflächenmodifikationstechniken sind vorgeschlagen worden, die basieren, zB auf photoreaktiven Verbindungen 12,13 oder Laserablation 5,14, um nur einige zu nennen. Die vorgeschlagenen Verfahren sind gut durch Robertus et al von Choi et al. 16 und Nakanishi 17 überprüft. 15, und in jüngerer Zeit.
Hier in diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode der in-situ-Oberflächenmodifizierung, die Vorteile der photokatalytischen Zersetzung von organischen Molekülen auf einem Titandioxid nimmt (TiO 2) Fläche 18,19. In diesem Verfahren wird ein TiO 2 -Film zwischen dem Glassubstrat und dem organischen Film, der die Zellen eine Schnittstelle eingeführt und der organische Film in situ durch lokales Bestrahlen mit ultravioletten (UV) zerlegtLicht in einem interessierenden Bereich (λ <388 nm). Wir zeigen, dass das neue Protokoll kann verwendet werden, um Mikrostrukturen der extrazellulären Matrixproteinen und lebenden Zellen sowohl ex situ und in situ zu erzeugen. TiO 2 ist biokompatibel, chemisch stabil und optisch transparente, Features, von denen macht es freundlich in Zellkulturexperimenten einzuführen. Dieses Protokoll stellt eine Materialwissenschaften basierte Alternative zur Modifizierung von Zellkultur-Gerüsten in Zellkulturumgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unserem aktuellen Protokoll wurde TiO 2 Film von RF-Magnetron-Sputtern gebildet. Wir bevorzugen diese Methode der Abscheidung, da es uns erlaubt, reproduzierbare Herstellung einer photokatalytischen TiO 2 -Schicht mit einer sub-nm Rauheit. Obwohl Sputter-Abscheidungsverfahren vertraut Materialwissenschaftler und Elektronik-Ingenieure sind, kann es nicht ganz zugänglich Biologen sein. In diesem Fall würde spinnbeschichteten TiO 2 -Films 23 eine Alternative sein. Bei diesem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
