Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

A variação genética responsável pelo alelo falciforme (HbS) permite eritrócitos para resistir à infecção pelo parasita da malária, P. falciparum. A base molecular da resistência a este, que é conhecida por ser multifactorial, permanece incompletamente compreendida. Estudos recentes descobriram que a expressão diferencial de microRNAs de eritrócitos, uma vez translocados em parasitas da malária, afetar tanto a regulação gênica e crescimento do parasita. Estes miARNs foram posteriormente mostrados para inibir a tradução do ARNm através da formação de um transcrito de ARN quimérico através de 5 'do RNA de fusão com subconjuntos discretos de mRNAs do parasita. Aqui, as técnicas que foram usadas para estudar o papel funcional e putativos mecanismo microRNAs eritrócitos subjacentes na regulação gênica e potencial translacional de P. falciparum, incluindo a transfecção de microRNAs sintéticos modificados em eritrócitos de acolhimento, serão detalhados. Por fim, um método de gradiente de polissoma é usado para determinar a extensão da TRAnslation destes transcritos. Juntas, essas técnicas nos permitiu demonstrar que os níveis desregulados de microRNAs eritrócitos contribuir para a célula-intrínseca resistência da malária dos eritrócitos falciformes.

Introduction

A malária, causada por parasitas apicomplexan do gênero Plasmodium, é a doença parasitária humana mais comum, infectando mundialmente cerca de 200 milhões de pessoas por ano e causando cerca de 600.000 mortes ^1. Dos cinco espécies de Plasmodium que infectam os humanos, o mais relevante para a doença humana são P. falciparum e P. vivax, devido às suas distribuições generalizadas e potencial para complicações graves de malária. O ciclo de vida do parasita da malária requer infecção de ambos os mosquitos e seres humanos. Quando um mosquito infectado pica um humano, os parasitas viajar através da corrente sanguínea para o fígado, onde uma rodada inicial de replicação ocorre. Depois merozoites ruptura do hepatócito hospedeiro, infectam os glóbulos vermelhos próximos, quer iniciar a replicação assexuada ou sexual. A fase assexuada de replicação, que dura 48 horas em P. falciparum, é o foco deste estudo, uma vez que é a fonte da maior parte malsintomas Aria e é facilmente recapitulou in vitro.

Embora uma série de iniciativas de saúde pública, incluindo as terapias anti-malária melhoradas, ter um pouco reduzido o fardo do paludismo a nível mundial, o surgimento contínuo de parasitas resistentes aos medicamentos constitui um problema para os esforços de controle da malária. Uma área que pode sugerir novas abordagens terapêuticas é o estudo sobre como as várias variantes genéticas conferem resistência à malária. Em regiões endêmicas de malária, uma variedade de polimorfismos eritrocitários são bastante comuns ^2,3. Estas mutações, com falciforme sendo talvez o mais importante, estão muitas vezes associados com substancial resistência ao aparecimento de infecção por malária sintomática ^4. Os mecanismos subjacentes pelo qual eles causam eritrócitos para resistir à infecção da malária são completamente compreendidas. Eritrócitos parasitados com mutações da hemoglobina estão sujeitos a fagocitose aumentada através de uma maior rigidez celular e desidratação, queestá associada à diminuição invasão pelo P. falciparum ^5. O alelo HbC também afecta a expressão da proteína na superfície do eritrócito e com a remodelação do citoesqueleto, inibindo a continuação do desenvolvimento do parasita ^6,7. Finalmente, P. falciparum cresce pouco dentro de foice homozigoto (HbSS) ^8,9 eritrócitos in vitro, sugerindo fatores eritrocitários intrínsecas de resistência da malária. No entanto, embora todos esses mecanismos parecem desempenhar um papel, eles não explicar completamente os mecanismos de resistência das células falciformes trás para a malária.

Um conjunto de fatores eritrocitários potencial que continuam a ser mal compreendido é a grande piscina de miRNA presentes dentro de eritrócitos maduros. MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes, 19-25 nt de tamanho, que medeiam a tradução e / ou estabilidade de mRNAs alvo por emparelhamento de bases dentro da UTR 3 '. Eles têm sido implicados no controlo de respostas imunitárias de mamíferos, incluindo a supressão óf replicação do vírus ^10, e foram exibidas para conferir resistência a vírus em plantas Eles também têm sido mostrados para regular vários processos, incluindo a eritropoiese eritrocitárias ^11,12 e metabolismo do ferro ^13. Estudos anteriores identificaram uma população abundante e diversificada de miRNAs eritrocitários, cuja expressão foi alterada drasticamente nos HbSS eritrócitos ^14,15. Desde eritrócitos maduros falta de transcrição e tradução activo, o papel funcional destas miARNs eritrocitárias permanece obscura. Como material de troca significativa ocorre entre a célula hospedeira e P. falciparum durante o ciclo de desenvolvimento intraerythrocytic (IDC) ^16, especulou-se que o perfil de miARN alterado dentro eritrócitos HbS podem contribuir directamente para a célula-resistência intrínseca a malária.

Estes estudos culminaram no desenvolvimento de um gasoduto para isolar, identificar e funcionalmente estudar o papel de miARN humana dentro do mAlaria parasita, P. falciparum, que indicou que esses hospedeiros / miRNAs humanos em última análise, de forma covalente fusível e, em seguida, traducionalmente reprimir transcritos de ARNm parasita ^17. Isto proporcionou um exemplo dos primeiros cruzada entre espécies transcritos quiméricos formados por trans-splicing e implica que esta fusão ARNm-miARN pode estar a ocorrer em outras espécies, incluindo outros parasitas. Todos os mRNAs de tripanossomas são trans-emendado com uma tala-líder (SL) para regular a separação de transcrições policistrónicos ^18. Desde P. falciparum carece orthologs para Dicer / Ago ^19,20, é possível que miRNAs eritrócitos seqüestrar máquinas SL semelhante em P. falciparum para integrar genes-alvo. Estudos recentes em P. falciparum têm, de facto, indica a presença de sequências líder 5 'da tala ^21. Este estudo detalha os métodos que levaram à descoberta de humanos-parasita miRNA-RNAm transcrições de fusão, incluindo tanto transcriptomic e translatécnicas de regulação adicionais. Os objetivos gerais destes métodos são a investigar os efeitos de pequenos RNAs na regulação gênica, fenótipos e tradução potencial de P. transcrições falciparum.

A identificação inicial de transcritos quiméricos humano-parasita invocado a utilização de técnicas de análise de RNA, tais como PCR em tempo real, o seqüenciamento do transcriptoma e EST captura biblioteca, que incluía tanto totais e pequenos RNAs, em vez de usar as técnicas que só isoladas pequenos RNAs. Isolamento de ARN todos juntos em um tanque grande, em vez de separadamente, permitiu a identificação de ambos os pequenos RNAs humanos translocados do parasita, assim como a presença destas sequências de ARN pequenos, como parte de uma sequência maior. Este então necessária uma análise do estado tradução destes ARNms de fusão para determinar as consequências funcionais destas fusões.

Enquanto esforços extensivos sobre a caracterização do genoma do parasita umad transcriptoma contribuíram para a compreensão da biologia do parasita ^22-25, muito menos se sabe sobre a regulação da tradução do mRNA transcriptoma em todo o ciclo de vida de P. falciparum ^26. Esta compreensão limitada do proteoma do parasita tem dificultado tanto a compreensão da biologia do parasita ea capacidade de identificar novos alvos para a próxima geração de terapias anti-malária. Esta lacuna na compreensão da biologia celular do parasita persiste em grande parte devido à falta de técnicas adequadas para investigar regulação traducional em P. falciparum. Um estudo recente descreveu o uso de pegada ribossomal de P. falciparum para determinar o status de tradução global ^21. Uma medição bem estabelecido de potencial de translação dos transcritos corresponde ao número de ribossomas associados determinados pelo perfil polissoma. No entanto, quando esta técnica é aplicada a P. falciparum </ em>, é incapaz de recuperar a maioria polissomos e captura predominantemente monosomes. Recentemente, vários grupos ^27,28 otimizaram P. técnicas polissomas falciparum por lise do eritrócito e parasita simultaneamente para preservar os polissomos e caracterizar a ocupação ribossômica e potencial translacional desses parasitas da malária durante o seu desenvolvimento assexuado em hospedeiras células vermelhas ^28.

Coletivamente, esses métodos demonstram que a fusão observado de miRNA e parasitas mRNAs humanos modula a tradução da proteína do parasita desses mRNAs de fusão, que foi demonstrada utilizando métodos previamente relatados ^27, e é um importante determinante da resistência da malária em HbAS e ¹⁷ HbSS eritrócitos. Estes métodos seriam úteis em qualquer sistema de procura para identificar e explorar funcionalmente eventos de splicing de ARN, ARN de fusão se estas estão dentro P. falciparum ou outros sistemas eucariotas.

Protocol

1: Isolamento de RNAs de pequeno porte de P. falciparum Durante o IDC Obter parasitas da malária na cultura assexuada 29. NOTA: O tamanho cultura requerida irá variar de acordo com a aplicação desejada; No entanto, uma cultura de 10 ml em 3-5% de parasitemia e 5% de hematócrito fornece amplo para ARN-PCR em tempo real (RT-PCR). A técnica foi inicialmente otimizado para culturas assíncronas, mas quando são desejados momentos específicos durante o ciclo de infecção, os para…

Representative Results

Perfil global de microARN humana em P. falciparum As técnicas aqui apresentadas foram usadas para extrair microARNs de parasitas em uma variedade de condições. Uma coisa a notar é que extrações de RNA para glóbulos vermelhos não infectados foram realizados como indicado na 32, que muitas vezes serviu como um ponto de referência para os dados de microRNA apresentadas tanto este artigo e do estudo original 29. Esses estudos também demonstraram …

Discussion

HbS é uma das variantes da hemoglobina mais comuns em áreas endêmicas de malária, em grande parte porque ele fornece proteção contra a malária grave causada por P. falciparum. As técnicas necessárias para caracterizar o papel do microRNA humana na regulação de genes de P. falciparum são detalhadas ao longo deste manuscrito. Ao extrair o RNA total de modo a incluir todos os pequenos RNAs, e através da realização de um procedimento de lise parasita relativamente simples, estes ARN…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)